趙雅寧 郭 霞 陳長(zhǎng)香 陳桂芝 李淑杏 李建民 (河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000)

睡眠不足 (部分睡眠剝奪)是常態(tài)老年人常見(jiàn)現(xiàn)象。研究發(fā)現(xiàn)睡眠不足與老年人認(rèn)知功能減退密切相關(guān)，可導(dǎo)致導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶能力下降，反應(yīng)遲鈍，注意力分散，定向障礙，出現(xiàn)幻覺(jué)等〔1〕;但其具體的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。p38絲裂原蛋白激酶 (MAPK)是一真核細(xì)胞廣泛表達(dá)的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，活化后通過(guò)調(diào)控底物如炎癥因子，凋亡蛋白等表達(dá)，參與Alzheimer病認(rèn)知障礙、血管性癡呆等疾病病理?yè)p傷過(guò)程〔2，3〕。β 淀粉樣肽 (Aβ)是前體蛋白 (APP)通過(guò)蛋白酶解途徑裂解成的長(zhǎng)度為39～43個(gè)氨基酸的片段，是神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物。但如果Aβ表達(dá)增加，作用時(shí)間延長(zhǎng)，則可在海馬、及新皮質(zhì)等部位沉淀、堆積，并對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察不同睡眠剝奪 (SD)時(shí)間對(duì)老齡大鼠海馬區(qū)磷酸化P38MAPK蛋白和Aβ表達(dá)的影響，并應(yīng)用P38MAPK蛋白抑制劑SB203580進(jìn)行干預(yù)，為進(jìn)一步闡明SD損害認(rèn)知功能的可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組和模型制備 雄性SD老齡大鼠90只〔北京維通利華公司，合格證:SCXK(京)2002-003〕，12～14月齡，體質(zhì)量(330±20)g，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、SB203580干預(yù)組，每組又隨機(jī)平均分為SD1 d、3 d、5 d 3個(gè)亞組。采用改良多平臺(tái)法制備快速動(dòng)眼SD模型。睡眠剝奪箱大小30 cm×30 cm×150 cm，其中央放置一徑為6 cm，高8 cm的平臺(tái)。剝奪箱內(nèi)注有水，水面低于平臺(tái)2 cm，水溫保在(20±2)℃。大鼠可以在平臺(tái)上自由攝取食物和水，但當(dāng)進(jìn)入睡眠時(shí)骨骼肌的松弛使大鼠掉入水中而驚醒，造成 SD。對(duì)照組除平臺(tái)增大為直徑13 cm，其余因素與SD組一致，大鼠在大平臺(tái)上可以部分活動(dòng)，并可以進(jìn)入睡眠。

1.2 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察(HE染色) 各組動(dòng)物在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)以戊巴比妥鈉麻醉(40 mg/kg)，用40 g/L多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定后取腦，后固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，片厚5 μm。切片二經(jīng)甲苯脫蠟，梯度乙醇降至水，HE染色。每只鼠連續(xù)3張冠狀背側(cè)海馬切片，采用圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)計(jì)數(shù)正常神經(jīng)元，取均值。

1.3 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫組化 切片常規(guī)脫蠟至水，枸櫞酸鹽微波修復(fù)，分別滴加磷酸化P38MAPK抗體(1∶200)、Aβ抗體(1∶150)，濕盒中4℃過(guò)夜，IgG抗體-HRP多聚體(PV二步法)，37℃溫箱30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。鏡下觀察并攝片，陽(yáng)性率的定量分析:每個(gè)標(biāo)本取5張切片，400倍光鏡下每張切片在海馬隨機(jī)選取4個(gè)視野，用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)對(duì)各組陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行吸光度(absorbance，A)分析。

1.4 免疫印跡法測(cè)定磷酸化P38MAPK和Aβ 大鼠致死后，迅速取雙側(cè)海馬區(qū)組織，稱量0.6 g，4℃PBS充分洗滌，加入3倍體積的4℃全細(xì)胞裂解液，冰浴中勻漿，4℃離心5 min，12 000 r/min，取上清?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)各樣本的蛋白含量，樣本貯存于－80℃?zhèn)溆谩z測(cè)步驟:蛋白樣品40 μg與等體積上樣緩沖液混合，煮沸10 min，100 g/L十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜，封閉液室溫下震蕩2～3 h，加入抗體(磷酸化 P38MAPK，1∶2 000;Aβ，1∶1 500)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜，標(biāo)記的二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，用圖像分析儀測(cè)定光密度，作定量分析。

1.5 學(xué)習(xí)和記憶功能檢測(cè) 按照 Smith等〔4〕的方法，采用Morris水迷宮進(jìn)行檢測(cè)，上午、下午各一次，記錄各組老齡大鼠搜索安全島(即平臺(tái))潛伏期時(shí)間(單位時(shí)間:s);和撤去平臺(tái)后動(dòng)物穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)，取檢測(cè)記錄的總均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 病理結(jié)果 對(duì)照組海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊致密，可見(jiàn)少數(shù)變性壞死的神經(jīng)元;模型組中，海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)在1 d即出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞變性水中，隨時(shí)間延長(zhǎng)至3 d、5 d，經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷明顯，視野內(nèi)可見(jiàn)有死亡形態(tài)改變的神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞周圍空隙增寬、胞核皺縮濃染等，存活神經(jīng)元密度明顯減少(P＜0.05);SB203580干預(yù)后形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，存活神經(jīng)元密度均增加(P＜0.05)。見(jiàn)表1、圖1。

2.2 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫組化結(jié)果 磷酸化p38MAPK陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，少量表達(dá)在細(xì)胞漿;Aβ陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)。陽(yáng)性細(xì)胞的胞質(zhì)可見(jiàn)細(xì)小的棕黃色顆粒。對(duì)照組大鼠海馬區(qū)有少量磷酸化p38MAPK和Aβ的陽(yáng)性細(xì)胞，染色較淡。SD后1 d、3 d、5 d，磷酸化P38MAPK和Aβ均呈不同程度地表達(dá)，二者陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在海馬敏感區(qū)CA1區(qū)、其次在CA2、CA3區(qū)，齒狀回也少量有分布。磷酸化p38MAPK陽(yáng)性反應(yīng)SD后1 d開(kāi)始逐漸增強(qiáng)，5 d達(dá)高峰，此時(shí)顯色最深。Aβ在SD后1 d逐步增高，5 d達(dá)高峰，顯色最深。SB20358干預(yù)組中P38MAPK和Aβ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目和陽(yáng)性反應(yīng)灰度值減弱。見(jiàn)圖2、圖3，表2、表3。

表1 各組海馬區(qū)的神經(jīng)元密度比較(± s，n=10)

表1 各組海馬區(qū)的神經(jīng)元密度比較(± s，n=10)

1)與對(duì)照組比較，2)與模型組比較:P＜0.05，下表同

模型組 17.85±3.921) 15.65±3.181) 12.12±2.981)SB203580 20.63±3.461)2) 18.86±3.071)2) 17.63±3.281)2)

表2 海馬磷酸化p38MAPK蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

表2 海馬磷酸化p38MAPK蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

組別1 d 3 d 5 d對(duì)照組1.96±0.58 1.88±0.62 1.98±0.64模型組 4.28±1.251) 8.60±3.201) 12.68±4.591)SB203580組 2.98±1.002) 4.86±2.282) 8.48±3.682)

圖1 各組神經(jīng)元形態(tài)變化(箭頭示壞死神經(jīng)細(xì)胞)(HE，×200)

圖2 各組磷酸化p38MAPK的表達(dá)(DAB，×400)

圖3 各組Aβ養(yǎng)性神經(jīng)元(DAB，×400)

2.3 磷酸化P38MAPK和Aβ免疫印跡法分析結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組中磷酸化p38MAPK、Aβ蛋白水平在SD 1 d、3 d、5 d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)上調(diào)。SB20358干預(yù)組中磷酸化p38MAPK、Aβ蛋白水平下降。見(jiàn)表4、表5。

表3 海馬Aβ蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

表3 海馬Aβ蛋白的吸光度比較(± s，n=10)

組別1 d 3 d 5 d對(duì)照組1.40±0.37 1.52±0.55 1.48±0.52模型組 4.78±2.011) 7.98±3.291) 10.68±4.261)SB203580組 2.54±1.162) 4.16±2.082) 6.48±3.282)

2.4 學(xué)習(xí)記憶功能結(jié)果 與對(duì)照組比較，模型組老齡大鼠搜索安全島潛伏期為明顯延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)減少(P＜0.05);SB20358干預(yù)可縮短老齡大鼠搜索安全島潛伏期時(shí)間、增多穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)(P＜0.05)，見(jiàn)表6。

表4 海馬磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較(± s，n=10)

表4 海馬磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)水平比較(± s，n=10)

?

表5 海馬Aβ蛋白表達(dá)水平比較(± s，n=10)

表5 海馬Aβ蛋白表達(dá)水平比較(± s，n=10)

?

表6 各組大鼠水迷宮檢測(cè)結(jié)果(± s，n=10)

表6 各組大鼠水迷宮檢測(cè)結(jié)果(± s，n=10)

組別 潛伏期(s)1 d 3 d 5 d穿越平臺(tái)次數(shù)(次)1 d 3 d 5 d對(duì)照組 65.5±8.5 64.7±6.8 65.8±8.5 9.20±1.52 9.25±1.62 9.31±1.58模型組 98.5±21.81) 115.6±24.51) 128.8±28.01) 6.48±1.111) 4.88±1.261) 2.28±1.101)SB203580組 78.0±18.71)2) 80.5±25.71)2) 96.8±24.81)2) 7.98±1.321)2) 6.68±1.121)2) 4.17± 1.151)2)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用“改良多平臺(tái)睡眠剝奪法”建立動(dòng)物模型，對(duì)老齡大鼠進(jìn)行不同時(shí)間的SD，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，隨SD時(shí)間延長(zhǎng)，模型組中老齡鼠搜索安全島潛伏期為明顯延長(zhǎng)、穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)減少，說(shuō)明SD可降低老齡鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu)，在學(xué)習(xí)和記憶功能以及調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)活動(dòng)中起重要作用。研究顯示損毀雙側(cè)海馬可大大妨礙動(dòng)物視覺(jué)分辨學(xué)習(xí)，使大鼠Y迷宮分辨學(xué)習(xí)和防御條件反應(yīng)的保持遭到嚴(yán)重的破壞〔5〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨睡眠剝奪時(shí)間延長(zhǎng)，模型組動(dòng)物海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在第3、5天可見(jiàn)明顯壞死細(xì)胞，說(shuō)明睡眠剝奪可造成海馬結(jié)構(gòu)損傷。近期研究顯示在Alzheimer's病(AD)、老年性癡呆等認(rèn)知功能障礙等病變中，均有海馬區(qū)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)生紊亂〔2，3〕。MAPKs信號(hào)通路是連接大多數(shù)細(xì)胞外信號(hào)與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號(hào)通路，其家族成員包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、C-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK等。研究認(rèn)為P38MAPK信號(hào)的活化對(duì)中樞神經(jīng)系的影響主要表現(xiàn)為負(fù)性調(diào)節(jié)作用，其活化后通過(guò)介導(dǎo)了許多炎性因子和致病因素，直接對(duì)海馬神經(jīng)突觸可塑性產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的損傷從而致空間學(xué)習(xí)能力受損〔6，7〕。胡亞卓等〔8〕發(fā)現(xiàn)多奈哌齊可改善血管癡呆模型動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶成績(jī)，而這與抑制海馬區(qū)P38MAPK活化有關(guān)。本研究結(jié)果，隨SD時(shí)間延長(zhǎng)，海馬區(qū)磷酸化p38MAPK明顯增高，給予SB2035806干預(yù)后，海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損害減輕、磷酸化p38MAPK表達(dá)下降、動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶得到改善，這說(shuō)明P38MAPK信號(hào)活化參與了睡眠剝奪導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷的病理過(guò)程，并在該進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用。

Aβ來(lái)源于它的前體物質(zhì)淀粉樣前體蛋白APP通過(guò)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切而產(chǎn)生〔9〕，具有神經(jīng)毒性，包括:介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、損傷膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。已有研究表明:APP和學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，APP缺陷的小鼠出現(xiàn)年齡依賴性的認(rèn)知功能的障礙，大腦神經(jīng)元突觸密度下降〔10〕。在AD的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，Aβ疫苗可以抑制Aβ斑的形成，阻止認(rèn)知能力的衰退〔11〕。本研究結(jié)果顯示，模型組中大鼠海馬區(qū)Aβ濃度明顯增加，提示SD導(dǎo)致認(rèn)知功能損傷與Aβ有關(guān)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)SB2035806組海馬區(qū)Aβ表達(dá)減少，說(shuō)明SD過(guò)程中，P38MAPK信號(hào)活化與Aβ產(chǎn)生有關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)〔12〕推測(cè)SD后活化的P38MAPK信號(hào)通過(guò)介導(dǎo)炎性因子IL-1β及TNF-α形成，促進(jìn)Aβ的沉積，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，神經(jīng)功能缺失。SD后P38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與Aβ之間的確切機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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