黃 萍，王五宏，李必元，岳智臣，鐘新民

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

大白菜 ［BrassicacampestrisL．ssp．pekinensis(Lour．)Olsson］是十字花科蕓薹屬蕓薹種的一個亞種，又名結(jié)球白菜，原產(chǎn)我國，是我國栽培歷史最悠久、種植范圍最廣泛、栽培面積最大、銷售時間最長的蔬菜，尤其在秋、冬季蔬菜供應(yīng)中處主導(dǎo)地位。實踐證明，大白菜生產(chǎn)的好壞直接影響著我國蔬菜市場供應(yīng)和人民生活。但是，近年來干燒心病成了危害大白菜生產(chǎn)的主要病害之一。此病是由缺鈣引起的生理性病害［1－2］，國內(nèi)外學(xué)者對干燒心病的表觀性狀、發(fā)病機理及防治方法方面進行了大量研究，但深入到分子方面的研究卻鮮見報道［3－4］。本實驗以高抗品系小孢 C8和高感品系651A及其雜交的F2代為材料，利用AFLP技術(shù)和BSA法相結(jié)合，通過210對引物組合對大白菜干燒心病的AFLP標(biāo)記進行篩選，以期建立大白菜抗干燒心病AFLP分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，為開展白菜抗干燒心病分子標(biāo)記輔助育種提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

以浙江省農(nóng)科院蔬菜所十字花科蔬菜育種課題組提供的DH系小孢C8和高代自交系651A及小孢C8×651A的F2代分離群體為材料。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 (CTAB小量法)

將2 mL離心管蓋大小新鮮葉片2～3片放入研缽中，加300 μL 2%的CTAB緩沖液研磨，然后再加入300 μL CTAB緩沖液混勻;65℃水浴1 h，其間上下顛倒混勻數(shù)次，1 h后取出冷卻至室溫;然后加入700 μL 24∶1的氯仿/異戊醇的混合液，上下顛倒搖晃使氯仿/異戊醇與樣品充分混勻;12 000 r·min－1離心10 min;將上清液取出 放入到已滅菌的1.5 mL離心管中，然后加入等體積的異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，4℃冰箱靜置30 min以上;10 000～12 000 r·min－1離心 10 min，棄上清液;棄掉上清液之后將離心管倒置于吸水紙上半小時以上，使異丙醇揮發(fā)干凈;必要時可以在通風(fēng)櫥里通風(fēng)，加速揮發(fā);揮發(fā)干凈后，加入50～100 μL的dd H2O(含 1μL 10 mg· ml－1的 RNase) 溶 解DNA，室溫30 min除去RNA;將提取好的DNA儲存在－20℃的冰箱中備用。

1.2.2 基因組DNA濃度及純度檢測

用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，取5 μL模板，加入1 μL Loading Buffer，混勻后加入到1%的瓊脂糖凝膠樣孔中，在1%TAE緩沖液中電泳30 min，電壓為150 V，紫外燈凝膠成像系統(tǒng)下觀察。并以50，100，150，200 mg·L－14 個梯度的 λDNA 為對照，觀察對照及樣品DNA亮度，判斷樣品DNA質(zhì)量并估計濃度，記錄各樣品濃度，最后將樣品濃度統(tǒng)一調(diào)至 20 ～100 mg·L－1。

1.2.3 AFLP標(biāo)記

AFLP的操作流程參照中國農(nóng)科院蔬菜改良中心生物技術(shù)室的方法，DNA的酶切連和選擇擴增的濃度稍有改動。

酶切連接反應(yīng)體系共 25 μL:dd H2O 15.5 μL，10 × NEB buffer2 2.5 μL，ATP(10 mmol)0.5 μL，100 × BSA 0.25 μL，EcoR I adapter(5 pmol)0.25 μL，MseI adapter(50 pmol)2.5 μL，EcoR I(10 U)0.25 μL，MseI(10 U)0.25 μL，3 unit T4 DNA ligase 0.5 μL，DNA(50 ～250 ng)?；靹蚝?7℃水浴或PCR儀中過夜約12 h。

預(yù)擴增反應(yīng)體系 10 μL:dd H2O 5.95 μL，10× PCR buffer 1.0 μL，10 mmol dNTPs 0.2 μL，E1(10 pmol·μL－1)0.3 μL，M1(10 pmol·μL－1)0.3 μL，Taq-polymerase(2 units·μL－1)0.25 μL，酶切連接后模板2 μL。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 1 min，24個循環(huán);最后72℃10 min;4℃保存。

選擇性擴增反應(yīng)體系 10 μL:dd H2O 6.05 μL，10 × PCR buffer 1.0 μL，10 mmol dNTPs 0.2 μL，Mse-primer(10 pmol·μL－1)0.5 μL，Eco-primer(10 pmol·μL－1)0.5 μL，Taq-polymerase(2 units·μL－1)0.25 μL，40 × 稀釋后產(chǎn)物 1.5 μL。反應(yīng)程序:94℃ 3 min;94℃ 30 s→65℃ 30 s→72℃ 1 min，每次循環(huán)的退火溫度降低0.7℃，共12個循環(huán);94℃ 30 s→56℃30 s→72℃ 1 min，共25個循環(huán);72℃ 延伸5 min，4℃ 保存。

電泳檢測:選擇性擴增反應(yīng)結(jié)束后，將10 μL反應(yīng)體系中加入6×Loading buffer(載樣緩沖液)8 μL，95℃ 變性 10 min，立即置于冰上冷卻。6% 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，每個樣品取4 μL上樣，70 W恒功率預(yù)電泳2 h，至溴酚蘭剛剛跑出電泳板下端時卸板，銀染檢測。

1.2.4 AFLP分析

采用相關(guān)分析法，對AFLP標(biāo)記與大白菜干燒心病發(fā)病指數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系進行分析，計算相關(guān)系數(shù)，并驗證AFLP標(biāo)記與白菜干燒心病基因之間的連鎖關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

把預(yù)擴增的產(chǎn)物稀釋40倍作為選擇性擴增的模板，選用EcoR I引物15條與MseI引物14條相互組合，共210對AFLP引物組合分別對抗病親本池R、感病親本池S、F2抗病池 BR、F2感病池BS進行擴增。擴增結(jié)果 (圖1)顯示，大部分引物在4個池間都能穩(wěn)定地擴增出清晰的條帶。210對引物中，引物 E-AGA/M-CAG在抗病親本池R、感病親本池S、F2抗病池BR、F2感病池BS中能穩(wěn)定的擴增出一條差異帶，該條帶命名為E10/M05，圖1中箭頭所指即為E10/M05。

圖1 部分AFLP引物對在4個模板間的擴增譜帶

通過對親本池及F2群體里的抗病池與感病池的篩選，得到1條穩(wěn)定的差異帶，為檢驗該標(biāo)記是否適用于在整個F2代群體分析，從F2代群體里挑選10個高抗單株和10個高感單株用該引物進行擴增，擴增結(jié)果見圖2。

由圖2可見，在20個小群體中10個高抗單株中均無出現(xiàn)該條帶，而10個高感單株中都擴增出了此條帶。因此，該標(biāo)記可能與某一感病基因具有一定的相關(guān)性，為進一步驗證該標(biāo)記，擴大F2群體到49個單株，擴增結(jié)果見圖3。

通過49個小群體擴增結(jié)果可以看出，在26株抗病單株中，有5株出現(xiàn)該條帶，在23株感病單株中均出現(xiàn)該條帶，由此推測該標(biāo)記可能與干燒心某一感病基因具有連鎖性，為驗證該連鎖性，將該標(biāo)記在整個F2代群體里進行擴增，結(jié)果顯示E10/M05引物組合所檢測到的多態(tài)性標(biāo)記E10/M05與大白菜干燒心病感病性狀是相連鎖的，這個標(biāo)記與大白菜干燒心病某個感病基因共分離?？共∮H本及抗病單株無條帶，感病親本及感病單株有條帶。在136個F2單株中，E10/M05標(biāo)記與干燒心病情級數(shù)的相關(guān)系數(shù)為0.633(r=0.633＞r0.01=0.228)，達(dá)到極顯著相關(guān)。該標(biāo)記的存在與干燒心病病情指數(shù)的增加達(dá)到了極顯著相關(guān)，表明該標(biāo)記與控制大白菜干燒心病的某個感病基因緊密連鎖。

圖2 引物組E10/M05在651A、小孢C8、BR、BS及20個小群體中的擴增結(jié)果

圖3 引物組E10/M05在651A、小孢C8、BR、BS及其49株單株中的擴增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

關(guān)于大白菜分子標(biāo)記的研究一直受到高度重視。目前，抗蕪菁花葉病毒 (TuMV)［5］、雄性不育［6］、耐熱性［7］、軟腐?。?］和大白菜葉球相關(guān)性狀［9］、大白菜葉色相關(guān)性狀［10］及部分形態(tài)性狀［11］等重要性狀的分子標(biāo)記研究取得了一定進展。對于大白菜干燒心病的研究，前人主要是集中在發(fā)病原因、發(fā)病機理、防治措施、癥狀表現(xiàn)及影響因素等方面，深入到分子方面的研究卻少見報道。孫秀峰等 (2006)首次將大白菜干燒心的研究深入到分子方面，構(gòu)建了一張含105個標(biāo)記位點，11個連鎖群，覆蓋長度為669.7 cm的大白菜的AFLP分子遺傳圖譜。并檢測到4個與抗干燒心病有關(guān)的QTL位點，其解釋的遺傳變異范圍在11.0%～58.9%之間。將大白菜干燒心病的研究深入到了分子層面，為利用分子標(biāo)記輔助選育大白菜抗干燒心病品種進行了開創(chuàng)性工作［3］。本實驗以高抗品系小孢C8和高感品系651A及其雜交的F2代為材料。利用AFLP技術(shù)和BSA法相結(jié)合，通過210對引物組合對大白菜干燒心病的AFLP標(biāo)記進行篩選，最終找到了1個AFLP標(biāo)記能在2個親本以及抗、感病池中擴增處差異條帶。然后從F2代中挑選出高抗和高感單株各10株進行驗證，發(fā)現(xiàn)感病單株均有該條帶，抗病單株均無該條帶，進一步擴大群體到49個，初步估計該標(biāo)記與目的基因具有連鎖關(guān)系。最后，在整個F2群體中進行驗證，結(jié)果顯示該標(biāo)記E10/M05與大白菜干燒心病表觀性狀是相連鎖的，這個標(biāo)記與干燒心病某個感病基因共分離。

然而本實驗的不足之處在于用于篩選標(biāo)記的個體相對不多，所選引物的多態(tài)性比率相對較低，下一步實驗應(yīng)擴大引物對及F2群體，確定標(biāo)記與抗病基因的遺傳距離，用于白菜抗干燒心病育種工作。

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