陳培芬 羅雅玲 賴文巖 邢曉雯 譚家余 駱子義 邱智輝

1 廣東省深圳市第三人民醫(yī)院內(nèi)科 5180114; 2 南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院呼吸科3 心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室; 4 廣州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科

氣道重塑是哮喘具有特征性的病理改變之一。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ膠原纖維和成肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白組成[1]。Ⅰ型膠原的沉積促使管壁增厚和僵硬,被認(rèn)為是早期氣道重塑的重要指標(biāo)[2]。巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage MIg ration inhib itory facto r,MIF)是體內(nèi)一種重要的多功能細(xì)胞因子,具有促炎、免疫調(diào)節(jié)等功能。循環(huán)血中的嗜酸性粒細(xì)胞在佛波酯或白介素-5的刺激下可分泌MIF[3]。國外的研究提示MIF在哮喘氣道炎癥中起重要作用[4,5]。新近的研究提示MIF在氣道重塑中起重要作用[6],但具體機(jī)制未明。本研究探討了MIF在人胚肺成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原合成中的作用及其途徑以初步探討其在氣道重塑中的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 M RC-5細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;DM EM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清購自PAA公司;recombinan t MIF(rMIF)、TGF-β1ELISA試劑盒購自 R&D 公司;T rizo lRNA抽取試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Fermen tas生物技術(shù)有限公司;PCR引物由上海英駿公司合成;鼠抗人Ⅰ型膠原抗體購自San ta Cruz;H RP-兔抗鼠IgG(Ⅱ抗)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;Rho激酶抑制劑Y27632購自BioSource公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組。M RC-5細(xì)胞培養(yǎng)于加入10%胎牛血清的DM EM 培養(yǎng)液中,放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組,實(shí)驗(yàn)組分別加入100μg/L的 rMIF。

1.2.2 RT-PCR方法檢測Ⅰ型膠原m RNA的表達(dá)。使用6孔板,對照組和實(shí)驗(yàn)組孵育完成后收集細(xì)胞,T rizol提取總RNA,用紫外分光光度計檢測純度。反應(yīng)分2步進(jìn)行:取5μl總RNA,在M-M LV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成DNA;再取1μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Ⅰ型膠原上游引物為5'-GCTGGCTACTTCTCGCTCTG-3',下游為5'-AGCAGT TGGAGGCTGTGGG-3',產(chǎn)物大小267 bp;GAPDH上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCA TCAC-3',下游引物:5'-TCCACCACCCTGTTGCTG TA-3',產(chǎn)物大小450 bp。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 5 MIn,94℃ 1MIn,53℃ 45s,72℃1MIn,進(jìn)行36個循環(huán),最后72℃延伸10MIn。每一PCR反應(yīng)重復(fù)3次。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離,紫外透射反射儀觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及亮度并攝影。使用IPP 6.0圖像分析軟件對擴(kuò)增條帶進(jìn)行分析,以平均灰度值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量,并除以GAPDH灰度值,所得數(shù)值作為各擴(kuò)增產(chǎn)物m RNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 Western b lo tting檢測Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)。用預(yù)冷PBS洗細(xì)胞3次,加入200μl蛋白裂解液,刮起細(xì)胞,4℃12 000×g離心15MIn,吸取上清,BCA法測定總蛋白濃度。取 40μg的上述樣品加樣至15%的SDS-PAGE凝膠,電泳,待溴酚藍(lán)接近凝膠底部時停止電泳,用轉(zhuǎn)移緩沖液把凝膠上蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上,膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉液封閉1h,加入1∶500稀釋的鼠抗人Ⅰ型膠原抗體及β-actin單克隆抗體于4℃孵育12h,然后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育1h,TBST洗膜后用ECL液顯影,以β-actin為內(nèi)參照,用IPP6.0圖像分析軟件對Ⅰ型膠原蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.2.4 EL ISA法檢測培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白表達(dá)。取對數(shù)生長期M RC-5細(xì)胞1×103個接種于6孔板中,培養(yǎng)24h;換無血清培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)24h,使細(xì)胞進(jìn)入生長靜止期;吸棄各孔培養(yǎng)基,換為終濃度為100μg/L rMIF的含10%胎牛血清的DM EM 2m l,分別培養(yǎng) 6、12、24、28h;分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,4℃下3 000×g離心10MIn,收集上清。按試劑說明書測定TGF-β1蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)的M RC-5形態(tài) 如圖1所示,光鏡下見M RC-5細(xì)胞生長旺盛,分布密集,多呈長梭形、細(xì)胞走向趨于一致,近于排列,并有一定的弧形。高倍鏡下可見長梭形細(xì)胞的細(xì)胞體飽滿、有2～3個扁平而長的突起,細(xì)胞核較大,呈卵圓形且多居中。

圖1 人肺成纖維細(xì)胞M RC-5(×100)

2.2 rMIF對M RC-5培養(yǎng)上清 TGF-β1蛋白濃度的影響 如圖 2、表 1所示,與同一時間點(diǎn)未加rMIF的對照組比較,100μg/L的rMIF刺激M RC-5細(xì)胞 6h、12h、24h、48h 后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF-β1濃度無顯著變化(P＞0.05)。

圖2 rMIF(100μg/L)刺激M RC-5細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清 TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

2.3 100μg/L rMIF刺激促進(jìn)M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原m RNA轉(zhuǎn)錄,拮抗Rho激酶抑制此促進(jìn)作用如圖3所示,100μg/L的rMIF刺激48h后,M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原m RNA合成顯著增加(P＜0.01);Rho拮抗劑預(yù)刺激后,rMIF促進(jìn)Ⅰ型膠原m RNA合成能力顯著減弱(P＜0.01)。

表1 rMIF(100μg/L)刺激 MRC-5細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

表1 rMIF(100μg/L)刺激 MRC-5細(xì)胞后不同時間點(diǎn)細(xì)胞培養(yǎng)上清TGF-β1濃度(pg/m L)(±s,n=6)

注:與對照組比較,P均＞0.05。

組別TGF-β1濃度(pg/m L)0h 6h 12h 24h 48h對照組 68.49±15.01 86.34±16.50 67.84±11.38 55.20±10.78 48.42±10.11 rMIF(100μg/L) 68.49±15.01 94.41±13.15 70.15±13.52 55.03±9.85 48.93±6.09

圖3 Y27632對rMIF刺激的 MRC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)的影響

2.4 100μg/L rMIF刺激促進(jìn)M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成,拮抗Rho激酶抑制此促進(jìn)作用 如圖4所示,100μg/L的rMIF刺激48h后,M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成顯著增加(P＜0.01);Rho拮抗劑預(yù)刺激后,rMIF促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白合成能力顯著減弱(P＜0.01)。

圖4 Y27632對rMIF刺激的M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

3 討論

MIF既是一種細(xì)胞因子,又是一種源于垂體的激素,還可作為糖皮質(zhì)激素生理活動的負(fù)反饋調(diào)節(jié)劑,具有廣泛的生物學(xué)功能的細(xì)胞因子。MIF可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞合成Ⅰ、Ⅲ型膠原m RNA和Ⅰ型膠原蛋白,參與高血壓血管重構(gòu)[7],與動脈內(nèi)膜增厚有關(guān)[8]。Sasaki等[9]發(fā)現(xiàn)MIF還可促進(jìn)腎小球纖維化形成。提示MIF在膠原合成和器官纖維化中具有重要作用。以MIF拮抗劑ISO-1治療慢性哮喘小鼠,可減輕氣道重塑,提示MIF在氣道重塑中起重要作用[6]。但MIF如何參與該過程,機(jī)制未明。

成纖維細(xì)胞(fib rob last,FB)氣道黏膜下的主要結(jié)構(gòu)細(xì)胞之一,其產(chǎn)生的膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維等沉積于基底膜,使氣道壁進(jìn)一步增厚。哮喘患者增厚的基底膜層主要是由Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ膠原纖維和成肌纖維細(xì)胞產(chǎn)生的纖維連接蛋白組成[1]。Ⅰ型膠原的沉積促使管壁增厚和僵硬,與α-平滑肌肌動蛋白一起被認(rèn)為是早期氣道重塑的重要指標(biāo)[2]。因此作者探討了MIF與Ⅰ型膠原合成之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明,rMIF可促進(jìn)Ⅰ型膠原m RNA和蛋白合成。這提示MIF可能通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原合成而參與哮喘的氣道重塑。MIF導(dǎo)致M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原表達(dá)增多的機(jī)制尚不清楚。最近發(fā)現(xiàn),MIF可激活Rho激酶途徑[10]。在調(diào)控血管緊張素Ⅱ刺激大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖與膠原合成中,Rho激酶具有重要作用[11]。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forMIng pro tein kinase,ROCK)是Rho蛋白的下游靶效應(yīng)分子之一。Y 27632是在細(xì)胞生物學(xué)和藥理學(xué)研究中廣為應(yīng)用的ROCK抑制劑。本研究在rMIF刺激M RC-5細(xì)胞前預(yù)先用Y 27632處理,觀察其對rMIF促進(jìn)Ⅰ型膠原合成中的影響。結(jié)果顯示,rMIF誘導(dǎo)M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原合成的能力可被Y27632所抑制。由于Y 27632只特異性作用于Rho激酶,因此本結(jié)果提示Rho激酶信號通路可能參與了rMIF誘導(dǎo)的M RC-5細(xì)胞Ⅰ型膠原合成。

TGF-β1是一個很重要的促纖維化細(xì)胞因子,在哮喘氣道重塑中起重要作用。哮喘患者氣道TGF-β1表達(dá)增加,與病情的嚴(yán)重程度和上皮下纖維化程度相關(guān)[12]。TGF-β1可誘導(dǎo)鼠成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13],增加膠原Ⅰ和Ⅲ合成而引起肺纖維化[14]。H o lgate等報道TGF-β1可促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成、細(xì)胞外基質(zhì)積聚及向肌成纖維細(xì)胞表型分化[15,16]。在人細(xì)胞上,Batra等[17]的研究提示TGF-β1的促纖維化機(jī)制是通過提高成纖維細(xì)胞生長、膠原產(chǎn)生和促進(jìn)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成肌纖維細(xì)胞以產(chǎn)生更多的膠原和細(xì)胞外基質(zhì)等而實(shí)現(xiàn)的。本研究也探討了rMIF刺激M RC-5細(xì)胞后TGF-β1的表達(dá)。結(jié)果顯示,100μg/L的 rMIF刺激 6h、12h、24h、48h后,細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 TGF-β1濃度無顯著變化。這提示 rMIF誘導(dǎo)M RC-5細(xì)胞膠原合成可能與TGF-β1的作用無關(guān)。之前筆者在哮喘小鼠肺中觀察到 TGF-β1表達(dá)增加,拮抗MIF可使小鼠TGF-β1表達(dá)下調(diào)[6],與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不大一致。究其原因有:(1)rMIF未影響到M RC-5細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β1蛋白水平,但未必不影響其m RNA和細(xì)胞內(nèi)蛋白水平,應(yīng)進(jìn)一步檢測上述2個指標(biāo);(2)巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和EOS均能分泌TGF-β1。rMIF對M RC-5分泌TGF-β1無影響,但不能除外影響巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、EOS等分泌 TGF-β1進(jìn)而影響了哮喘小鼠肺TGF-β1的表達(dá);(3)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)的差別。究竟何種原因所致有待進(jìn)一步研究。

總之,MIF可能通過Rho途徑刺激成纖維細(xì)胞膠原Ⅰ型合成從而在哮喘氣道重塑的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

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