劉穎蕾，劉曼華，邱君君，陳麗平，張忠新，劉宏斌

研究表明，卵巢血流變化能較深入地反映卵巢功能活動和病理現(xiàn)象［1］。卵巢內(nèi)膜樣囊腫 (ovarian endometriosis cyst，OEC)病理過程中，由于其生物學(xué)行為具有侵蝕性，可破壞卵巢間質(zhì)致纖維化改變、微血管損傷，目前缺乏對此種病理改變的全面研究及其與超聲血流變化關(guān)系的深入探討。本文就此進(jìn)行研究，術(shù)前采用經(jīng)陰道彩色多普勒超聲 (transvaginal color Doppler sonography，TV－CDS)檢測OEC卵巢間質(zhì)血流變化，術(shù)后通過免疫組化檢測卵巢間質(zhì)組織標(biāo)本中轉(zhuǎn)化生長因子－β1(transforming growth factor－β1，TGF－β1)、血小板反應(yīng)蛋白－1(thrombospondin－1，TSP－1)及微血管密度 (microvessel density，MVD)的表達(dá)，探討OEC間質(zhì)血流對卵巢組織損傷的預(yù)測價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 研究組:選擇2008年10月—2010年4月在我院手術(shù)治療的 OEC患者60例，年齡25～40歲，平均(33.5±3.3)歲;B超測得所有囊腫長徑2.5～6 cm，單側(cè)44例，雙側(cè)16例，共計患病卵巢76個。對照組:選擇同期在我院手術(shù)治療的卵巢良性腫瘤患者30例 (成熟畸胎瘤10例，漿液性囊腺瘤10例，黏液性囊腺瘤10例)，年齡23～40歲，平均 (33.3±3.1)歲。本研究中因年齡＞40歲者正常卵巢血流顯示率低［2］，均予以剔除，各組年齡分布間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05)，均知情同意，有性生活史。所有患者入院前3個月無激素類藥物治療史，無其他內(nèi)分泌及全身性疾病史，無婦科手術(shù)史，術(shù)后均經(jīng)病理證實。

1.2 研究方法

1.2.1 超聲檢查 應(yīng)用Philips iU－22超聲診斷儀，經(jīng)陰道探頭，頻率10～15 MHz。受檢者于圍排卵期行超聲檢查，選取卵巢間質(zhì)中較明顯的動脈進(jìn)行觀測，緊鄰卵泡或接近卵巢表面的動脈不作為觀測目標(biāo)。超聲檢查由同一位婦科B超醫(yī)師進(jìn)行。監(jiān)測項目: (1)卵巢間質(zhì)動脈血流顯像，血流分級按Alder半定量標(biāo)準(zhǔn)［3］:0級為無血流顯示，Ⅰ級呈星點狀血流顯示，Ⅱ級呈棒狀或條狀血流顯示，Ⅲ級血流信號呈網(wǎng)狀。(2)卵巢間質(zhì)動脈血流阻力指數(shù) (resistance index，RI)。

1.2.2 病理檢查 收集術(shù)前有血流顯示的卵巢間質(zhì)組織蠟塊切片。采用免疫組化SP法染色，鼠抗人TGF－β1單克隆抗體(克隆號:Sc－146)、鼠抗人TSP－1單克隆抗體 (克隆號:A6.1)購自美國New Markers公司。鼠抗人CD34單克隆抗體(克隆號:QBEnd/10)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。以PBS代替一抗做陰性對照。

結(jié)果判定:采取雙盲法閱片，由兩名不知臨床資料的病理醫(yī)師判定。(1)TGF－β1、TSP－1染色后主要定位于卵巢間質(zhì)細(xì)胞胞漿，呈棕褐色。陽性結(jié)果的判定以著色程度及陽性細(xì)胞百分率綜合判斷:①著色強度:無棕黃色為0分，淡棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。②陽性細(xì)胞百分率:陽性細(xì)胞≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將①和②積分相乘，0～4分為陰性或弱陽性 (－)，5～8分為陽性 (+)，9～12分為強陽性 (++)。(2)MVD測定:通過CD34標(biāo)記內(nèi)皮細(xì)胞以顯示血管，CD34陽性染色為棕褐色，主要定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿。先在低倍鏡 (100倍)下觀察CD34表達(dá)較強的區(qū)域即“熱點”區(qū)，繼而高倍鏡 (×400)下讀取3個視野并將圖像放大輸入計算機以計數(shù)微血管數(shù)目。肌層太厚及管腔面積大于8個紅細(xì)胞直徑的血管均不計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，根據(jù)資料性質(zhì)分別采用獨立樣本t檢驗、χ2檢驗、Fisher確切概率法、秩和檢驗及Spearman等級相關(guān)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本文要點

卵巢內(nèi)膜樣囊腫 (ovarian endometriosis cyst，OEC)的生物學(xué)行為具有侵蝕性，可破壞卵巢間質(zhì)致纖維化改變、微血管損傷，但目前尚缺乏對此種病理改變的全面研究及其與超聲血流變化關(guān)系的深入探討。本研究術(shù)前應(yīng)用經(jīng)陰道彩色多普勒超聲檢測60例OEC患者及30例卵巢良性腫瘤患者的卵巢間質(zhì)血流信號及阻力指數(shù)(RI)，術(shù)后采集有血流顯示的囊腫或腫瘤周邊間質(zhì)進(jìn)行免疫組化染色，檢測轉(zhuǎn)化生長因子－β1(TGF－β1)、血小板反應(yīng)蛋白－1(TSP－1)及微血管密度 (MVD)。結(jié)果顯示，卵巢間質(zhì)血流變化與TGF－β1、TSP－1和MVD表達(dá)的改變從不同角度反映了OEC的病理狀態(tài);超聲檢測卵巢間質(zhì)血流可前瞻性地預(yù)測OEC對卵巢組織的損傷。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前TV－CDS檢測卵巢間質(zhì)血流 研究組60例OEC患者76個患側(cè)卵巢血流不豐富，以Ⅰ級為主，占52.63%(40/76，見圖1)，0級占32.89% (25/76)，血流呈高阻型，RI值為 (0.73±0.05)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，見表1)。

表1 兩組卵巢間質(zhì)動脈血流顯像及RI值的測定Table1 Color Doppler flow grade and RI values of ovarian interstitial arteries in OEC and control group

2.2 術(shù)后免疫組化結(jié)果及其與術(shù)前超聲血流RI值的關(guān)系

2.2.1 MVD計數(shù)及其與RI值的關(guān)系 研究組OEC卵巢間質(zhì)中MVD為 (5.87±1.44)個/400倍視野，顯著低于對照組(12.07±1.53)個/400倍視野，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=17.28，P＜0.01)。MVD與RI值呈負(fù)相關(guān) (rs=－0.91，P＜0.01)。

2.2.2 TGF－β1表達(dá)及其與MVD、RI值的關(guān)系 TGF－β1在研究組OEC卵巢間質(zhì)中的陽性表達(dá)率為70.59%(見圖2)，在對照組良性腫瘤的陽性表達(dá)率為24.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=17.23，P＜0.01)。TGF－β1表達(dá)與 MVD呈負(fù)相關(guān) (rs=－0.70，P＜0.01)，與 RI呈正相關(guān) (rs=0.77，P＜0.01)，表現(xiàn)為隨TGF－β1表達(dá)增高，MVD下降，RI值增高，具體見表2。

表2 TGF－β1表達(dá)與MVD、RI值的關(guān)系Table2 Relationships between MVD，RI values and TGF－β1 expression

2.2.3 TSP－1表達(dá)及其與TGF－β1、MVD、RI的關(guān)系 TSP－1在研究組OEC卵巢間質(zhì)中的陽性表達(dá)率為66.67%(見圖3)，在對照組良性腫瘤的陽性表達(dá)率為16.00%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=14.73，P＜0.01)。TSP－1表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān) (rs=－0.76，P＜0.01)，與TGF－β1、RI均呈正相關(guān) (rs=0.90、0.81，P＜0.01)，表現(xiàn)為隨TSP－1表達(dá)增高，MVD下降，TGF－β1表達(dá)與RI值增高，見表3。

表3 TSP－1表達(dá)與TGF－β1、MVD和RI值的關(guān)系Table3 Relationships between TGF－β1 expression rate，MVD，RI values and TSP－1 expression

圖1 OEC卵巢間質(zhì)內(nèi)Ⅰ級血流Figure1 Star－shaped signals(grade I flow)within the ovarian interstitium of an OEC patient

圖2 TGF－β1在OEC組中的表達(dá) (免疫組化SP×100)Figure2 Positive expression of TGF－β1 in the OEC group

圖3 TSP－1在OEC組中的表達(dá) (免疫組化SP×100)Figure3 Positive expression of TSP－1 in the OEC group

3 討論

3.1 超聲間質(zhì)血流評價OEC對卵巢間質(zhì)組織的損傷 TVCDS是近年興起的一種非損傷性評價盆腔器官血流灌注狀態(tài)的超聲檢查方法，它的應(yīng)用為我們更清楚地了解組織器官的生理功能變化和病理改變提供了一個無創(chuàng)的視窗。在圍排卵期，TV－CDS檢測到正常功能卵巢間質(zhì)血流豐富，多呈網(wǎng)狀［4］;卵巢良性腫瘤周圍間質(zhì)血流較豐富，多呈條狀。由此可見，不同的卵巢間質(zhì)血流可提示卵巢不同的病理生理狀態(tài)。OEC卵巢間質(zhì)血流不豐富、不易顯示、頻譜呈高阻型，RI值升高，本研究認(rèn)為這種變化顯示OEC病理過程中，因其生物學(xué)行為具有侵蝕性，囊腫周圍組織結(jié)構(gòu)及血管分布遭到破壞。

3.2 TGF－β1、TSP－1及MVD評價OEC對卵巢組織的損傷TGF－β1被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是纖維化形成與發(fā)展的啟動樞紐［5］，高表達(dá)于肺［6］、肝［7］、腎［8］纖維化組織中，在 OEC 卵巢間質(zhì)中TGF－β1表達(dá)增高，顯示OEC卵巢間質(zhì)纖維化。有研究認(rèn)為在組織器官纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases，MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinase－1，TIMPs)比例失調(diào)，抑制了細(xì)胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)降解，加速了組織纖維化形成［9－11］。劉曼華等［12］曾報道，MMPs－TIMPs平衡的破壞在OEC疾病浸潤、種植這一生物學(xué)行為中意義特殊。由此推斷，在OEC浸潤卵巢間質(zhì)過程中，各種內(nèi)、外源性因素刺激卵巢間質(zhì)，破壞MMPs－TIMPs平衡，導(dǎo)致卵巢ECM過度積聚，間質(zhì)組織發(fā)生纖維化改變。

TSP－1是TGF－β1的主要激活物［13］。OEC卵巢間質(zhì)中TSP－1高表達(dá)與TGF－β1表達(dá)增強相一致，提示這兩種細(xì)胞因子之間可能存在某種正反饋機制，即:在損傷因子的作用下，兩種細(xì)胞因子之中任何一種的異常表達(dá)都將啟動另一種的表達(dá)與活化，同時也會相互刺激而進(jìn)行性增高，導(dǎo)致卵巢間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展及加重。與近年來組織器官纖維化研究中提出的TSP－1、TGF－β1互為彼此激活物，促進(jìn)纖維化發(fā)生發(fā)展［14－15］的觀點相一致。

MVD是檢測微血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)，CD34單克隆抗體是血管內(nèi)皮細(xì)胞的最可靠標(biāo)記。OEC卵巢間質(zhì)內(nèi)CD34標(biāo)記的MVD降低，提示OEC組織學(xué)上雖為良性，卻有類似惡性侵襲的特殊生物學(xué)行為，但又不同于惡性腫瘤的間質(zhì)血管增生、血管網(wǎng)密集［16］，而表現(xiàn)為隨病情進(jìn)展不斷浸潤、侵襲、破壞卵巢間質(zhì)血管網(wǎng)。TGF－β1、TSP－1與MVD呈負(fù)相關(guān)，提示TSP－1、TGF－β1相關(guān)的卵巢間質(zhì)纖維化與微血管損傷有關(guān)，微血管損傷可能通過組織缺血、缺氧及營養(yǎng)障礙，刺激細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，參與組織纖維化，導(dǎo)致卵巢組織損傷。

3.3 超聲間質(zhì)血流RI值與TGF－β1、TSP－1及MVD的關(guān)系 OEC卵巢間質(zhì)血流RI與MVD呈負(fù)相關(guān)，提示這兩項指標(biāo)可從不同角度反映卵巢間質(zhì)血管網(wǎng)的改變，兩者相一致。RI又分別與TGF－β1、TSP－1呈正相關(guān)，考慮器官外周血管阻力的變化主要在于小動脈及微動脈的收縮程度，OEC卵巢間質(zhì)中TGF－β1、TSP－1表達(dá)上調(diào)，使得卵巢間質(zhì)纖維組織增生，血管壁順應(yīng)性降低，血管收縮受限，超聲表現(xiàn)為血流阻力增高、灌注減少。

總之，本研究結(jié)果顯示:超聲血流指標(biāo)與病理指標(biāo)具有一致性，我們認(rèn)為超聲檢測OEC卵巢間質(zhì)血流變化可反映活體內(nèi)卵巢間質(zhì)纖維化及微血管損傷，可實時動態(tài)地評價OEC的病理狀態(tài)，為進(jìn)一步了解OEC的卵巢組織改變提供了一種非創(chuàng)傷性方法。

1 Joanie Mayer Hope，Kara Long，Marek Kudla，et al.Three－dimensional power Doppler angiography of cyclic ovarian blood flow［J］.J Ultrasound Med，2009，28(8):1043－1052.

2 Delgado－Rosas F，Gaytán M，Morales C，et al.Superficial ovarian cortex vascularization is inversely related to the follicle reserve in normal cycling ovaries and is increased in polycystic ovary syndrome［J］.Hum.Reprod，2009，24(5):1142－1151.

3 Alder DD，Carson PL，Rubin JM，et al.Doppler ultrasound flow imaging in the study of breast canner:Preliminary findings［J］.Ultrasound Med Biol，1990，16(6):553－559.

4 段麗，周慧麗，向紅.卵巢早衰患者經(jīng)陰道彩色多普勒超聲檢查的聲像圖特征［J］.中國全科醫(yī)學(xué)，2010，13(6):2051.

5 Verrecchia F，Mauviel A.Transforming growth factor－beta and fibrosis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(22):3056－3062.

6 Salazar KD，Lankford SM，Brody AR.Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF－β1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297(5):1002－1011.

7 尚軍潔，李孝生.肝組織CTGF、TGF－β1的表達(dá)與肝纖維化關(guān)系的實驗研究［J］.中國誤診學(xué)雜志，2010，10(13):3032.

8 Tian L，Li C，Qi J，et al.Diabetes－induced upregulation of urotensin II and its receptor plays an important role in TGF－β1－mediated renal fibrosis and dysfunction［J］.Am J Physiol Endocrinol Metab，2008，295(5):1234－1242.

9 Kassiri Z，Oudit GY，Kandalam V，et al.Loss of TIMP3 enhances interstitial nephritis and fibrosis［J］.J Am Soc Nephrol，2009，20(6):1223－1235.

10 Catania JM，Chen G，Parrish AR.Role of matrix metalloproteinases in renal pathophysiologies［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2007，292(3):905－911.

11 Kwak HJ，Park MJ，Cho H，et al.Transforming growth factor－beta1 induces tissue inhibitor of metalloproteinase－1 expression via activation of extracellular signal－regulated kinase and Sp1 in human fibrosarcoma cells［J］.Mol Cancer Res，2006，4(3):209－220.

12 劉曼華，程英，陶潛.子宮內(nèi)膜異位癥與卵巢癌患者IL－6、IL－8變化及 MMP－9、TIMP－3的表達(dá)［J］.中國婦幼保健，2009，28(24):4019－4020.

13 Daniel C，Schaub K，Amann K，et al.Thrombospondin－1 Is an endogenous activator of TGF－β in experimental diabetic dephropathy in vivo［J］.Diabetes，2007，56(12):2982－2989.

14 Verrecchia F，Mauviela.Transforming growth factor－beta and fibrosis［J］.World J Gastroenterol，2007，13(22):3056－3062.

15 Christoph Daniel，Kathrin Schaub，Kerstin Amann，et al.Thrombospondin－1 is an endogenous activator of TGF－β in experimental diabetic nephropathy in vivo［J］.Diabetes，2007，56(12):2982－2989.

16 Tempe A，Singh S，Wadhwa L，et al.Conventional and color Doppler sonography in preoperative assessment of ovarian tumors［J］.Int J Gynaecol Obstet，2006，92(1):64－68.