吳皓瓊，牛彥波，殷 博，甄 濤

（黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江哈爾濱150010）

近10年來植物根圈促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)制劑越來越受到人們的青睞[1]。植物根圈促生菌是指自由生活在土壤或附生于植物根的一類可促進(jìn)植物生長及其礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌類。一般具有固氮、解磷、釋鉀、產(chǎn)生植物激素和分泌抗生素等能力或至少具有其中之一的能力。PGPR對土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物都有生防作用，對植物吸收利用礦物質(zhì)營養(yǎng)有促進(jìn)作用，并可以產(chǎn)生有益于植物生長的代謝產(chǎn)物，從而促進(jìn)植物的生長發(fā)育[2]。目前，有關(guān)植物促生菌PGPR的研究非常活躍，研究領(lǐng)域也非常廣泛，已從20多個種屬的根際細(xì)菌中鑒定出了具有防病促生潛能的PGPR菌，其中研究較多、較活躍的有假單孢菌屬（pseudomonas）和芽孢桿菌屬（bacillus）[3-5]。本項目組分離篩選的代號ASP-15產(chǎn)酸克雷伯氏（Klebsilla oxytoca）菌，兼具解磷、固氮及抑制病原真菌生長的功能，具有很好的應(yīng)用潛力[6，7]，本文研究比較了其不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液浸種對作物種子生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca）

代號ASP-15,由本項目組分離、保藏。

1.1.2 試劑

常規(guī)化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器設(shè)備

電熱恒溫培養(yǎng)箱；干燥箱；空氣浴振蕩器；超凈工作臺（1級）；電子天平；數(shù)顯型酸度計；手提式蒸汽消毒器；顯微鏡等。

1.1.4 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基配方采用肉湯培養(yǎng)基；搖瓶培養(yǎng)基配方采用糖蜜-玉米漿培養(yǎng)基(糖蜜15.0～20.0g，玉米漿 1.0～1.5g， 無 機(jī) 鹽 0.2g，H2O 1000mL)；30℃、150r/min空氣浴振蕩器培養(yǎng)24h，經(jīng)顯微鏡血球測定將活菌數(shù)調(diào)整在40×108～50×108cfu/mL間。

1.2 試驗方法

1.2.1 ASP-15不同稀釋倍數(shù)菌液浸種對種子發(fā)芽及生根的影響

在實驗室條件下,隨機(jī)選擇顆粒飽滿程度一致、健康的大豆、玉米、水稻種子，分組裝入小燒杯中，編號，種子表面用1%～2%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，清水沖洗干凈，分別以ASP-15菌不同稀釋倍數(shù)的菌液浸種。設(shè)5個處理：

處理1：ASP-15菌 原液浸種；

處理2：ASP-15菌 10倍稀釋液浸種；

處理3：ASP-15菌 100倍稀釋液浸種；

處理4：ASP-15菌 1000倍稀釋液浸種；

處理5：清水浸種（對照CK）。

每個處理3次重復(fù)，計150粒種子。大豆、水稻、玉米每個處理分別用4.5mL、1.0 mL、7.0 mL ASP-15菌不同稀釋倍數(shù)的菌液浸種30min，后用清水反復(fù)沖洗種子3次，分別置于鋪有濾紙的直徑9cm平皿中，25℃催芽48～96h，期間，適量補(bǔ)水使培養(yǎng)皿內(nèi)濾紙保持微微潮濕狀態(tài)，避免因水分不足而影響種子的生長，觀察種子的發(fā)芽及生長狀況。

1.2.2 ASP-15最適宜稀釋倍數(shù)浸種效果

在1.2.1工作的基礎(chǔ)上，通過對各處理種子發(fā)芽率及根長的比較分析，確定ASP-15菌浸種的最適宜稀釋倍數(shù)。

選擇最適宜濃度的ASP-15菌液浸種，操作同

1.2.1 ,設(shè)2個處理:

處理1：ASP-15菌 100～1000倍稀釋液浸種；處理2：清水浸種（對照CK）。

每個處理3次重復(fù)，計150粒種子。觀察種子的48h、72h發(fā)芽率及72h生根情況,并計算每粒種子黏附菌數(shù)。

2 結(jié)果及分析

2.1 ASP-15菌液不同稀釋倍數(shù)浸種狀況分析

結(jié)果見表1。從表1可以看出：ASP-15菌對作物種子的“作用”是各不相同，應(yīng)用于玉米和水稻種，不同稀釋倍數(shù)的ASP-15菌液都能或多或少地提高種子的發(fā)芽率及出芽時間，玉米種子浸種48h測定，處理組較清水對照組發(fā)芽率提高了12.87%～30.70%，其中100倍稀釋液表現(xiàn)最好，發(fā)芽率達(dá)88%，較對照提高30.7%；水稻種子浸種48h，發(fā)芽率提高了6.52%～28.02%，以1000倍稀釋液表現(xiàn)最好，發(fā)芽率達(dá)78.52%,較對照提高28.02%；應(yīng)用于大豆種子，僅僅處理3明顯提高了大豆種子的發(fā)芽率，48h較清水對照比提高了142.8%，72h較清水對照比提高了24.4%,而其余處理較清水對照發(fā)芽明顯受到抑制,可能是ASP-15菌代謝產(chǎn)物高濃度狀態(tài)對大豆的生長有抑制作用的緣故。根據(jù)各處理種子發(fā)芽率及生長情況，可以確定對大豆、玉米種子來說，處理3即100倍稀釋液浸種效果最好；對水稻來說，處理4優(yōu)勢明顯，為最佳。

表1 ASP-15不同稀釋倍數(shù)菌液對作物種子發(fā)芽率的影響Table 1 Effect of seed germination rate by the different diluted times ASP-15 bacteria on fermented liquor

2.2 ASP-15最適宜稀釋倍數(shù)浸種效果分析

結(jié)果見表2。從表2可以看出：在實驗室條件下，100-1000倍ASP-15菌稀釋液浸種，能夠顯著提高大豆、玉米、水稻種子的發(fā)芽率，特別是在發(fā)芽初期尤為明顯。培養(yǎng)48h測定，玉米發(fā)芽率為86.8%，同對照比，發(fā)芽率提高了23.47%；大豆發(fā)芽率為68.9%，提高了34.83%；水稻發(fā)芽率為80.7%，提高了29.53%。ASP-15菌除提高種子發(fā)芽率外，對作物根也有刺激生長作用，經(jīng)ASP-15菌處理的種子，其根表現(xiàn)為粗而長，根毛多而密。對于大豆、玉米來說，用ASP-15菌100倍稀釋液浸種，培養(yǎng)72h，根長的測定結(jié)果表明：處理組根長分別達(dá)到36.57mm、38.86mm，比對照（清水）增加了48.48%、39.98%，差異極顯著（t值6.252、5.243）；對水稻來說，1000倍ASP-15菌稀釋液對水稻生根刺激作用明顯，培養(yǎng)72 h處理組平均根長為34.59mm，對照組20.86mm，處理較對照相比，根長增加65.82%，差異極顯著（t值15.106）。通過測定每毫升活菌數(shù)及各種子質(zhì)量，可以得出每粒種子上吸附有ASP-15菌的個數(shù)。即大豆每粒種子至少吸附有3.6×106～4.5×106個菌、玉米每粒種子至少吸附有5.6×106～7.0×106個菌、水稻每粒種子至少吸附有8.0×104～1.0×105個菌時,ASP-15菌才能充分發(fā)揮作用(見表3)。

表2 ASP-15菌對作物種子的影響Table 2 Effect of the ASP-15 bacteria on seed

表3 每粒種子吸附ASP-15菌最低數(shù)量Table 3 The least number of the ASP-15 bacteria being absorbed into each seed

綜上所述，ASP-15菌作為活菌制劑，其功效是活菌體起關(guān)鍵作用，因此在應(yīng)用于浸種時，每粒種子上必須吸附上適宜數(shù)量的活菌，才能通過微生物在根際的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和代謝產(chǎn)物不斷形成，起到營養(yǎng)、促生作用。在本實驗中，ASP-15菌活菌數(shù)為40×108～50×108cfu/mL時，對大豆、玉米種子來說，用100倍稀釋液效果最好，每粒種子沾有不少于1×106個菌；對水稻種子來說，用1000倍稀釋液浸種即可，每粒種子不少于1×105個菌，與大豆、玉米種相差一個數(shù)量級。說明應(yīng)用微生物制劑時，必須考慮種子的吸附菌液的最適宜量，在充分進(jìn)行實驗基礎(chǔ)上，才能確定微生物對哪些作物有作用、最佳劑量是多少，不能一概而論。

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［2］劉淑琮，馮斷，于潔.植物根際促生菌的研究進(jìn)展及其環(huán)境作用［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,48(11)：2882～2886.

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［5］張偉瓊,聶明,肖明.熒光假單胞菌生防機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)志,2007,24(3):9～11.

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