呂寶軍 謝小銘 譚 敏

1．中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院普外II區(qū)，廣東 珠海 519000;2．中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院急診科，廣東 珠海 519000;3．中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院微創(chuàng)外科，廣東 廣州 510080

自80年代開(kāi)始，世界各國(guó)科學(xué)家，均深入研究了鯊魚(yú)軟骨的臨床應(yīng)用，并取得了令人矚目的成就［1]。中華鱘昵稱“水中熊貓”是一種在海洋中生長(zhǎng)，在淡水中繁殖的大型海河洄游性軟骨硬鱗魚(yú)類，除了頭部有幾塊膜化骨之外，全身都是軟骨［2]。我們擬從中華鱘軟骨分離得到中華鱘軟骨活性制劑，通過(guò)體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)其抗腫瘤效應(yīng)進(jìn)行了初步的研究，為我國(guó)生物醫(yī)藥的發(fā)展及寶貴資源的發(fā)掘開(kāi)辟了一條新路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑 中華鱘 (順德市創(chuàng)世紀(jì)農(nóng)業(yè)園饋贈(zèng))、Millipore超濾器 (5，000和100，000)(Amicon公司)、健康三級(jí)純系 BALB/c－nu裸小鼠 (雌性、體重相近20±0.2g、約6－7周齡)(中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)、人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞株 (中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2 中華鱘軟骨有效成分的抽提、分離和濃度的測(cè)定 剖取200g中華鱘軟骨，將中華鱘軟骨用組織粉碎機(jī)粉碎至勻漿，經(jīng)400ml1M鹽酸胍抽提48h，45% ～65%丙酮的分級(jí)沉淀，5，000分子量和100，000分子量的Millipore超濾器等步驟超濾得到中華鱘軟骨溶液a(全成份)、中華鱘軟骨溶液b(≥100，000分子量)、中華鱘軟骨溶液c(5，000～100，000)三種溶液，通過(guò)Bradford法測(cè)定中華鱘軟骨溶液蛋白質(zhì)的濃度。

1.3 體外抑制血管生成作用的實(shí)驗(yàn)研究 (付生法［3])濾紙放入打孔器中制作直徑1mm的濾紙片，高溫高壓消毒備用，將40只受精雞蛋表面酒精消毒后放入37.8℃孵化箱，孵化至第7天時(shí)，暴露出絨毛尿囊膜，將已經(jīng)消毒的濾紙小片放入中華鱘軟骨溶液a、中華鱘軟骨溶液b、中華鱘軟骨溶液c中浸濕后，部分放入生理鹽水中，分別選取10只雞胚，依次用小鑷子夾取a、b、c溶液以及生理鹽水中的濾紙片放入絨毛尿囊膜血管較少的部位作為a組、b組、c組、生理鹽水組，孵化2天后揭除透明膠帶取膜制作標(biāo)本，將制作的標(biāo)本攝像血管計(jì)數(shù)，以給藥點(diǎn)為中心，以半徑間隔5mm將雞胚絨毛尿囊膜劃分為3個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)各區(qū)域的主血管數(shù)的總和。

1.4 中華鱘軟骨活性成分抑制荷結(jié)腸癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 設(shè)8組，中華鱘軟骨溶液a灌喂組和腹腔注射組、中華鱘軟骨溶液b灌喂組和腹腔注射組、中華鱘軟骨溶液c灌喂組和腹腔注射組、生理鹽水灌喂組和腹腔注射組8組，每組10只，灌喂劑量0.2ml，腹腔注射同上，接種第二天開(kāi)始每日一次共用藥14天，人結(jié)腸癌lovo細(xì)胞懸液調(diào)整濃度為1×107/ml，每鼠右腋皮下接種0.2ml，用藥14天后用頸椎脫臼處死小鼠，解剖并完整的分離出皮下瘤塊，稱瘤重，計(jì)算平均瘤重和抑瘤率。抑瘤率 (%)=對(duì)照組平均抑瘤率－試驗(yàn)組平均抑瘤率/對(duì)照組平均抑瘤率×100%。

2 結(jié)果

2.1 超濾所獲得的中華鱘軟骨粗溶液a、b、c的濃度分別是 12.389mg/ml、34.048mg/ml、0.221mg/ml，見(jiàn)表 1。

表1 中華鱘軟骨溶液OD值與濃度的關(guān)系表

2.2 中華鱘軟骨活性成分抑制血管生成的體外實(shí)驗(yàn)研究目前，公認(rèn)的血管生長(zhǎng)抑制模型有兩種，即兔角膜誘生新生血管抑制模型和雞胚絨毛尿囊膜血管生長(zhǎng)抑制模型。我們應(yīng)用后一種模型來(lái)檢測(cè)軟骨蛋白的活性，結(jié)果表明，生理鹽水組血管生長(zhǎng)良好，血管分支適中，中華鱘軟骨溶液a、b、c與生理鹽水對(duì)照相比，軟骨對(duì)血管生成有明顯的抑制作用，血管分支減少，尤其以溶液c抑制效果較顯著，結(jié)果如表2、圖1所示。計(jì)數(shù)各處理組及各區(qū)域的主血管數(shù)，a組平均主血管數(shù)為 (21.52±3.64)，相對(duì)于生理鹽水平均主血管數(shù) (33.84±3.14)差異顯著 (t=2.47，P＜0.05);b組平均主血管數(shù)為 (28.41±2.13)，與生理鹽水組對(duì)照差異不顯著 (t=2.03，P＞0.05);c組平均主血管數(shù)為 (7.16±1.31)，相對(duì)于生理鹽水平均主血管數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (t=4.92，P＜0.05)。

表2 三組中華鱘軟骨溶液抑制血管生成的各區(qū)域的主血管數(shù) (x±s條)

2.3 如表3所示，中華鱘軟骨溶液a腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.41±0.06)、(0.53±0.03)，相對(duì)于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重 (0.52±0.08)、(0.56±0.04)腹腔注射組有所降低，且P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中華鱘軟骨溶液c腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.31±0.09)、(0.53±0.05)，相對(duì)于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重，腹腔注射組有所降低并且P＜0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中華鱘軟骨溶液b腹腔注射組和灌喂組的平均瘤重分別為 (0.46±0.07)、(0.59±0.06)，相對(duì)于生理鹽水注射組和灌喂組的平均瘤重P＞0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，中華鱘軟骨溶液對(duì)荷lovo結(jié)腸癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)具有抑制作用。中華鱘軟骨溶液a、溶液c以腹腔注射的方式對(duì)lovo結(jié)腸癌的生長(zhǎng)具有一定得抑制作用，尤其以溶液c抑制效果較為顯著。

表3 中華鱘軟骨對(duì)荷lovo結(jié)腸癌裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

3 討論

動(dòng)物軟骨是一種特殊的結(jié)締組織，由軟骨細(xì)胞、纖維和基質(zhì)構(gòu)成。軟骨中含有大量的粘多糖、胺基糖及豐富的活性蛋白，其中有多種抗腫瘤有效成分，如血管生成抑制因子、抗入侵因子和腫瘤細(xì)胞因子等［4]。軟骨血管抑制因子直接來(lái)源于動(dòng)物組織，無(wú)明顯的毒副作用，它與其他血管抑制劑不同，對(duì)人正常細(xì)胞無(wú)抑制作用，能夠特異的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，與內(nèi)皮生長(zhǎng)抑制素相比，僅用1/10的量，具有明顯高效的抑瘤率［5]。由于中華鱘人工繁殖和飼養(yǎng)的成功，與小牛軟骨來(lái)源和鯊魚(yú)來(lái)源的血管生成抑制因子相比，它的原料來(lái)源豐富。由于軟骨是生物機(jī)體主要的無(wú)血管組織，多年來(lái)，人們希望從中提純血管生成抑制因子，然而軟骨組織含有豐富的酸性年多糖等生物大分子，使得從中提取上述活性物質(zhì)尤其困難。血管生成是腫瘤持續(xù)生長(zhǎng)和發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要前提，在生長(zhǎng)初期，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)擴(kuò)散從細(xì)胞間隙獲得營(yíng)養(yǎng)和氧氣，但當(dāng)腫瘤增至1－2mm3時(shí)，內(nèi)部的細(xì)胞通過(guò)擴(kuò)散不能獲得足夠的氧氣和營(yíng)養(yǎng)滿足其繼續(xù)生長(zhǎng)和分裂的需要，腫瘤內(nèi)部形成缺氧狀態(tài)，這時(shí)缺氧作為一種環(huán)境信號(hào)啟動(dòng)了瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等血管生成正調(diào)控因子的表達(dá)，使腫瘤具有了促血管生成表型。腫瘤內(nèi)形成的血管提供了氧氣和營(yíng)養(yǎng)，也同時(shí)提供了腫瘤轉(zhuǎn)移的通路。如果腫瘤血管生成被抑制，就切斷了腫瘤生長(zhǎng)所需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，同時(shí)也切斷了腫瘤轉(zhuǎn)移的重要通路，使腫瘤處于無(wú)癥狀休眠狀態(tài)，再聯(lián)合其他手段就有可能徹底治愈腫瘤，這就是通過(guò)抑制血管生成治療腫瘤的理論基礎(chǔ)［6]。

我們通過(guò)粗略地將中華鱘軟骨分成幾個(gè)組分，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)對(duì)比各組分抑制血管生成的作用，發(fā)現(xiàn)軟骨c組分對(duì)血管的生成和腫瘤的增殖具有明顯的抑制作用，證明了中華鱘軟骨內(nèi)含有高效的血管生成抑制成分。

由于中華鱘軟骨中含有豐富的血管生成抑制因子，能夠抑制腫瘤血管生成而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且中華鱘軟骨中含有豐富的酸性粘多糖，能夠刺激機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤抗病能力。因此，我們認(rèn)為中華鱘軟骨制劑具有抗腫瘤作用，關(guān)鍵是應(yīng)該建立合理的制備工藝，有效提取軟骨抗腫瘤活性成分－血管生成抑制因子，同時(shí)剔除軟骨中存在的抗腫瘤有害成分－血管生成刺激因子和腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子。因此，從中華鱘軟骨中純化制備血管生成抑制因子應(yīng)用于抗血管生成新藥的開(kāi)發(fā)，具有重要意義。

［1]Mefly L，Simjee S，Smith SL．Induction of inflammatory cytokines by cartilage extracts［J]．Int Immunopharmacol，2007，7(3)：383 －391．

［2]吳立人．“保護(hù)中華鱘”的科技實(shí)踐活動(dòng)．生物學(xué)教學(xué)，2010，35(4)：49－51．

［3]付生法，陸應(yīng)麟，張朝山等．檢測(cè)血管生長(zhǎng)因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1993，17(4)：294－296．

［4]尚俊英，謝裕安，楊帆，等．鯊魚(yú)軟骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究．廣西醫(yī)學(xué)，2008，30(2)：156－158．

［5]余新威，羅紅宇，徐佳晶，等．赤魟軟骨新生血管抑制組分的制備及其活性的初步研究．浙江海洋學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，26(2)：147－149．

［6]Rabbani－Chadegani A，Abdossamadi S，Bargahi A，et al．Identification of low－molecular－weight protein(SCP1)from shark cartilage with anti－angiogenesis activity and sequence similarity to parvalbumin．J Pharm Biomed Anal，2008，46(3)：563－567．