華 燁， 葉 民

阿爾茨海默病(AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病，其病因與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)。研究表明，遺傳易感性在AD發(fā)病中具有重要作用［1］，而確定與AD發(fā)病有關(guān)的基因?qū)⒂兄诹私庠摬〉姆肿硬±砘A(chǔ)，并可能為人們提供合理的治療途徑。目前，僅有ApoEε4是公認(rèn)的AD發(fā)病的遺傳危險因素［2］，AD相關(guān)基因的研究還期待著更多的發(fā)現(xiàn)。

自從發(fā)現(xiàn)高同型半胱氨酸血癥是AD發(fā)病的獨(dú)立危險因子以來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注同型半胱氨酸代謝的關(guān)鍵酶-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)與AD發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，并進(jìn)行了大量的病例對照研究。研究發(fā)現(xiàn)，MTHFR基因第677位C→T突變(MTHFR C677T)可能與 AD發(fā)病相關(guān)［3］。但由于基因多態(tài)性頻率具有明顯的種族異質(zhì)性，且不同研究間存在實(shí)驗(yàn)設(shè)計、病例選擇標(biāo)準(zhǔn)和樣本含量之間的差異，導(dǎo)致研究結(jié)論存在明顯爭議。因此，本課題搜集了國內(nèi)外有關(guān) MTHFR基因C677T多態(tài)性與AD發(fā)病風(fēng)險的病例對照研究進(jìn)行Meta分析，綜合評價該多態(tài)在不同群體中的作用，期望較全面地認(rèn)識MTHFR基因C677T多態(tài)性與AD的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究目的 了解MTHFR基因C677T多態(tài)是否增加患AD的風(fēng)險。

1.2 研究對象 已公開發(fā)表的有關(guān)MTHFR基因C677T多態(tài)性與AD相關(guān)性的病例-對照研究資料。均為試驗(yàn)設(shè)計嚴(yán)謹(jǐn)，試驗(yàn)方法可靠的基因型頻率和/或等位基因頻率的病例對照研究。以其中的AD患者為研究病例，以健康人群為對照組。

1.3 研究(檢索)方法 以 Alzheimer＇s、MTHFR gene或阿爾茨海默病、MTHFR基因?yàn)闄z索詞，聯(lián)合檢索自1966年1月1日～2010年12月31日止的PubMed數(shù)據(jù)庫、EMBASE數(shù)據(jù)庫、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫和中國學(xué)術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫，獲得全部有關(guān)AD與MTHFR C677T多態(tài)性相關(guān)性的文獻(xiàn)，為避免遺漏上述電子數(shù)據(jù)庫未收錄和未發(fā)表的文獻(xiàn)資料，我們還對國內(nèi)一些大型學(xué)術(shù)會議的論文匯編進(jìn)行了手工檢索。沒有進(jìn)行語種限制，但僅查到英文和中文文獻(xiàn)。對發(fā)表文章中未包括的有關(guān)資料，與文獻(xiàn)的主要作者聯(lián)系并索取。

1.4 篩選(資料選擇標(biāo)準(zhǔn))

1.4.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)原始資料為已公開發(fā)表的文獻(xiàn);(2)原始文獻(xiàn)內(nèi)容為涉及MTHFR基因C677T多態(tài)的基因型頻率和/或等位基因頻率的獨(dú)立病例對照研究;(3)原始文獻(xiàn)類型為設(shè)計良好的隨機(jī)病例對照研究(有嚴(yán)格的對照，且有兩組人群的基本構(gòu)成)，AD診斷標(biāo)準(zhǔn)采用國際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計方法恰當(dāng)，數(shù)據(jù)表達(dá)明確;(4)各文獻(xiàn)研究方法相似;(5)各文獻(xiàn)有綜合的統(tǒng)計指標(biāo)，如比值比(OR)等;(6)符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

1.4.2 剔除標(biāo)準(zhǔn) (1)原始文獻(xiàn)內(nèi)容未涉及MTHFR基因C677T多態(tài)基因頻率的對照研究;(2)原始文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計不嚴(yán)謹(jǐn)(AD診斷標(biāo)準(zhǔn)不規(guī)范，統(tǒng)計方法不妥當(dāng)，樣本資料交代不清或不全，與原文作者聯(lián)系又未取得進(jìn)一步的補(bǔ)充數(shù)據(jù))。

1.4.3 研究開展的時間或文獻(xiàn)發(fā)表的年限、語種1966～2010;語種不限(檢索未發(fā)現(xiàn)除中英文之外的其他文獻(xiàn)，非人為限制文獻(xiàn))。

1.5 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 對各研究中對照組的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，以驗(yàn)證研究人群的代表性，不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律的文獻(xiàn)予以剔除。

1.6 資料提取(提取納入文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)信息)由神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師和流行病學(xué)工作者采用盲法獨(dú)立進(jìn)行文獻(xiàn)提取工作，分別進(jìn)行評價。按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)逐一篩選，最后納入19篇符合條件的文獻(xiàn)，累計AD病例組2269例，對照組2854例。

1.7 研究方法 利用已發(fā)表的研究MTHFR基因C677T多態(tài)性與AD關(guān)系的文獻(xiàn)，系統(tǒng)評價AD患者M(jìn)THFR基因型分布與正常人差異。以AD患者為觀察組，常規(guī)體檢健康人為對照組，分別觀察MTHFR等位基因(C/T)頻率及基因型頻率(包括TT/(CT+CC)和(CT+TT)/CC)與AD的相關(guān)性?？紤]到東西方人群的遺傳異質(zhì)性，本研究還根據(jù)研究對象來源的不同對亞洲人群和高加索人群進(jìn)行了亞組分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計分析采用Meta分析專用統(tǒng)計軟件Review Manager(4.2版)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，計算各研究等位基因頻率與OR值及其 95%可信區(qū)間(confidence interval，95%CI)。對各文獻(xiàn)結(jié)果進(jìn)行異致性檢驗(yàn)，并根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果選用相應(yīng)的數(shù)據(jù)合并方法，若各研究之間結(jié)果無顯著異質(zhì)性，則采用Peto Mantel-Haenszel固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并，若結(jié)果間存在顯著異質(zhì)性，則采用校正后的Dersimonian-Laird隨機(jī)效應(yīng)模型法進(jìn)行數(shù)據(jù)合并(D-L法)，計算總OR值。使用漏斗圖及Egger檢驗(yàn)評價發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索結(jié)果 共19篇文獻(xiàn)納入研究，AD組病例2269例，對照組2854例。其中12篇文獻(xiàn)［4～15］納入亞洲人群組，包括AD組病例1324例和對照組2045例，另外7篇文獻(xiàn)［16～22］納入高加索人群，包括AD組病例945例和對照組809例。入選文獻(xiàn)的資料(見表1)，等位基因和基因型分布(見表2)。研究對象均符合Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。

2.2 各研究組異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果 對19項(xiàng)研究進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)［23］，等位基因頻率T/C的比較各研究之間存在明顯的異質(zhì)性(I2=39.5%，P=0.04)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型;基因型頻率(CT+TT)/CC的比較各研究之間無明顯異質(zhì)性(I2=22.3%，P=0.18)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)合并。亞組分析中，等位基因頻率及基因型頻率的比較中，亞洲人群的12項(xiàng)研究之間均存在明顯的異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析;高加索人群的7項(xiàng)研究之間均無明顯異質(zhì)性，故采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析［24］(見表3)。

2.3 等位基因及基因型頻率分析 根據(jù)異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果，分別應(yīng)用固定效應(yīng)模型和隨機(jī)效應(yīng)模型法合并數(shù)據(jù)，計算OR值，并繪制森林圖。首先對全部19項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)行合并，顯示等位基因頻數(shù)T/C 的 OR 值為1.18，95%CI為 1.05 ～1.32，OR 值顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，基因型(TT+TC)/CC合并的OR 值為1.26，95%CI為1.11 ～1.43，OR 值顯著性檢驗(yàn)P＜0.05;根據(jù)研究人群來源進(jìn)行分層分析結(jié)果顯示，亞洲人群等位基因頻數(shù)T/C和(TT+TC)/CC的OR值的顯著性檢驗(yàn)P均＜0.05(OR值分別為1.32 和1.43，95%CI分別為1.09 ～1.59，1.22 ～1.69);而高加索人群等位基因頻數(shù)T/C和(TT+TC)/CC的OR值的顯著性檢驗(yàn)P均＞0.05(OR值分別為 0.98、1.05，95%CI分別為 0.85 ～1.13 和0.86 ～1.28)(見表3)。

表1 納入文獻(xiàn)的研究概況

表2 AD組和對照組MTHFR等位基因和基因型分布

表3 Meta分析結(jié)果

2.4 發(fā)表偏倚評估 RevMan漏斗形圖提示各點(diǎn)分布均勻，基本對稱。按Egger法［25］T/C及TT+TC/CC OR值除以其標(biāo)準(zhǔn)誤(作用大小)與標(biāo)準(zhǔn)誤的倒數(shù)(精確度)回歸分析，P分別等于0.39和0.26，均大于0.05，認(rèn)為無明顯的發(fā)表偏倚存在。

3 討論

AD是最常見的神經(jīng)變性疾病，臨床上以進(jìn)行性記憶、認(rèn)知障礙及行為異常為特征，隨著社會人口老齡化逐步加劇，AD的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，給社會和家庭帶來了巨大的負(fù)擔(dān)，因此，對AD的研究具有巨大的臨床意義。高同型半胱氨酸血癥被認(rèn)為是AD發(fā)病的獨(dú)立危險因素之一［26］。人類MTHFR基因定位于1p36.3，cDNA全長22kb。其 cDNA序列上第677位核苷酸易發(fā)生C到T的突變，產(chǎn)生一個Hinf I限制性酶切位點(diǎn)，造成編碼的氨基酸由丙氨酸變成纈氨酸，這種突變造成MTHFR活性下降，血漿Hcy水平增高［27］?；贛THFR在同性半胱氨酸的代謝中扮演的重要角色，故MTHFR被認(rèn)為在阿爾茨海默病的發(fā)病中或許有一定的作用。支持這一推論的另一證據(jù)是，MTHFR基因定位于染色體1p36.3，而這個區(qū)域被認(rèn)為可能與AD發(fā)病相關(guān)［28］。因此，形成了MTHFR基因可能與AD發(fā)病相關(guān)的假設(shè)。Nishiyama M［11］等在對日本的AD患者與MTHFR基因的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn):MTHFR基因突變與AD的發(fā)病有一定的相關(guān)性，這一結(jié)果引起了各國學(xué)者對于MTHFR基因的極大關(guān)注，但研究結(jié)果并不一致。因此，有必要對各項(xiàng)獨(dú)立研究結(jié)果進(jìn)行定量合并和綜合評價，以彌補(bǔ)單個研究不足，增加檢驗(yàn)效能，解決研究結(jié)果的不一致性。

本研究首次利用Meta分析，對目前國內(nèi)外進(jìn)行的關(guān)于MTHFR C677T多態(tài)與AD發(fā)病關(guān)系的研究進(jìn)行匯總分析，19項(xiàng)研究數(shù)據(jù)合并后，發(fā)現(xiàn)等位基因T/C 的 OR 值為 1.18，P=0.006，有統(tǒng)計學(xué)意義，認(rèn)為MTHFR T等位基因可能增加AD的患病風(fēng)險;而基因型(TT+TC)/CC合并的 OR值為1.26，P=0.0003，提示TT+TC基因型與AD患病也存在正相關(guān)關(guān)系。在亞組分析中，亞洲人群等位基因T/C、(TT+TC)/CC總體效應(yīng)檢驗(yàn)P均＜0.05，而高加索人群對等位基因、基因型的總體效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果完全相反，提示MTHFR C677T多態(tài)性可能增加亞洲人群AD患病的風(fēng)險，而與高加索人群AD患者的易感性無關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因多態(tài)性與AD易感性相關(guān)，但這種相關(guān)性僅在亞洲人群中存在，并且趨勢更明顯，在高加索人群中，沒有發(fā)現(xiàn)兩者的相關(guān)性。究其原因可能與不同人群的種族差異性相關(guān)。另外，AD的發(fā)生是個多因素、多步驟發(fā)展的過程，涉及基因-基因交互作用，基因-環(huán)境交互作用等多因素的作用，而這些因素可能會影響 MTHFR C677T基因多態(tài)性與AD的發(fā)病風(fēng)險。

Meta分析中存在各種偏倚，但以發(fā)表偏倚最為常見。漏斗形圖是初步判斷發(fā)表偏倚簡便易行的方法，但只能對結(jié)果作定性的判斷，Egger法可對發(fā)表偏倚作定量評估，是漏斗圖的有效補(bǔ)充，本研究將漏斗圖和Egger檢驗(yàn)法結(jié)合，未發(fā)現(xiàn)顯著的發(fā)表偏倚。另外，我們對所有納入文獻(xiàn)均進(jìn)行了H-W平衡檢驗(yàn)，所有研究均符合H-W遺傳平衡規(guī)律，可認(rèn)為本研究結(jié)論可靠。但是本研究仍存在一定的局限性:(1)樣本量相對較少。雖然我們將符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)都納入了Meta分析，但是由于關(guān)于MTHFR基因多態(tài)性的文獻(xiàn)本身較少，可能會降低Meta分析的統(tǒng)計效能;(2)其他相關(guān)因素的相互作用。在納入的19項(xiàng)研究中，有5項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MTHFR T等位基因與高Hcy水平相關(guān)，另有6項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與ApoEε4存在正相關(guān)關(guān)系，對于這些研究我們沒有進(jìn)行更進(jìn)一步的分層分析，也可能降低Meta分析的公信力;(3)不同研究的入選對象的入選標(biāo)準(zhǔn)和年齡及性別構(gòu)成的差異也可能對研究結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，MTHFR C677T基因多態(tài)性與AD易感性的研究有必要進(jìn)一步深入，為闡明易感基因在AD發(fā)病中的作用提供依據(jù)。

Meta分析作為循證醫(yī)學(xué)的一種定量分析方法，在AD遺傳學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛，相信隨著MTHFR基因多態(tài)性和AD相關(guān)性研究的深入和研究資料的積累，我們可以通過Meta分析進(jìn)一步明確MTHFR的基因變異對AD患病的影響，為AD的早期診斷和預(yù)防提供更多的依據(jù)。

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