張雪梅，陳海龍，王朝暉，張 利，紀 軍

肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar typeⅡ cells，ATⅡ）對維持肺泡的結構和功能具有重要意義，其功能包括增殖、合成和分泌肺表面活性物質、維持肺泡內外液體平衡及免疫調節(jié)作用。研究表明，急性肺損傷（acute lung injury，ALI）時肺組織的病理變化表現(xiàn)為肺泡上皮細胞的嚴重損傷。ATⅡ在肺損傷后肺泡上皮的修復與更新、表面活性物質的分泌、肺水轉運過程中均有重要意義[1-2]。但由于ATⅡ具有特殊的生物學特性，尚未形成細胞株供研究用，且其分離、純化、鑒定及原代培養(yǎng)的操作較為繁瑣，細胞形態(tài)功能易發(fā)生變化，給研究工作帶來不便。本實驗是在總結和借鑒國內外學者經驗的基礎上，改良大鼠ATⅡ的分離、培養(yǎng)及鑒定方法。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠20只（大連醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號SCXK（遼）2002-0002），體質量180～220 g。

1.2 主要實驗儀器 細胞培養(yǎng)箱（Heraeus德國）；研究級熒光倒置生物顯微鏡（Leica美國）；低溫離心機（Sigma美國）。

1.3 主要實驗試劑 達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（DMEM，GIBCO公司）；胎牛血清（FBS GIBCO公司）；大鼠IgG（Sigma公司）；脫氧核糖核酸酶（DN-ase，Sigma公司）；胰蛋白酶（Difico公司）；SP-A多克隆抗體(Santa Cruz公司)；SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要溶液 10%水合氯醛溶液。溶液Ⅰ：140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，6 mmol/L葡萄糖，0.2 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L磷酸氫鈉緩沖液。溶液Ⅱ：溶液Ⅰ，2.0 mmol/L CaCl2，1.3 mmol/L MgS04[3]。用1 M NaOH調pH至7.4。溶液Ⅲ：溶液Ⅱ，0.25%胰蛋白酶，0.1%膠原酶。D-Hank液；0.25%胰蛋白酶，0.25%DNaseⅠ溶液。

2 方法

2.1 肺組織的消化及細胞混懸液的制備 大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg，肝素400 U/kg。消毒，氣管插管，腹主動脈放血活殺，剪開胸腔，去除胸腺。注射器吸取溶液Ⅱ（預溫至37℃），于右心耳的位置輕輕進入朝肺動脈的方向注入，灌洗至全肺呈蒼白色以去除血細胞，灌注量20 mL；經氣管插管用溶液Ⅰ灌洗8次，再用溶液Ⅱ灌洗2次，至灌洗液清亮，去除巨噬細胞；溶液Ⅲ灌洗1次。快速取出肺移入超凈操作臺，溶液Ⅱ沖洗肺表面，經氣管注入預溫至37℃、0.25%胰酶消化液20 mL。37℃水浴消化25 min。去除肺門、大氣道，在4 mL D-Hanks液中（含DNase 250 μg/mL），將肺剪碎至1 mm3大小。5 mL小牛血清滅活胰酶，移入無菌三角瓶，溶液Ⅱ補足至20 mL/肺，37 ℃水浴搖床130 r/min，5 min。細胞濾網過濾2次（150目，200目）。濾液移入50 mL無菌離心管以800 r/min、4℃離心8 min。細胞沉淀用10 mL DMEM重懸，計數(shù)[3-5]。

2.2 大鼠ATⅡ的純化 IgG溶液倒入無菌培養(yǎng)皿內完全覆蓋底部，22℃靜置3 h，倒出IgG，PBS洗5次，DMEM洗2次，吸盡后另加入少量DMEM，4℃下靜置24 h備用。將上述細胞懸液調整至濃度為106/mL，轉移至用大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育90 min，移出未黏附的細胞，4℃、800 r/min離心l0 min棄上清，無血清DMEM漂洗1次[6-7]。

2.3 ATⅡ的培養(yǎng) DMEM重懸細胞沉淀，調整細胞濃度為2×106/mL，轉入六孔培養(yǎng)板，每孔加細胞懸液1 mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)。24 h后移去未貼壁細胞，加入DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察細胞生長狀況。

2.4 ATⅡ活力的測定 細胞懸液和0.5%臺盼藍染液按l∶1體積比混合后滴加蓋玻片，1 min后計數(shù)100個細胞，用活細胞占計數(shù)細胞的百分比表示細胞活力。

2.5 ATⅡ的鑒定 用免疫組化染色和透射電鏡觀察來鑒定ATⅡ。無菌載玻片置于培養(yǎng)皿底部，培養(yǎng)24 h后完成細胞爬片。丙酮固定5 min，按SABC免疫組化試劑盒操作說明完成免疫組化染色。SP-A抗體工作濃度為1∶200，陰性對照用PBS代替一抗。用蘇木素復染，中性樹脂封片后觀察結果[8]。透射電鏡鑒定ATⅡ：細胞懸液2 000 r/min離心10 min，棄上清，2.5%戊二醛固定過夜，PBS漂洗、鋨酸后固定、梯度乙醇脫水、丙酮包埋，切成50～70 nm厚的切片，醋酸鈾染色，檸檬酸鉛復染，透射電鏡下觀察。

3 結果

3.1 ATⅡ光鏡形態(tài) 分離純化的ATⅡ細胞單層貼壁生長，在光鏡下呈圓或橢圓形，直徑10～20 μm，胞漿內含較多包含體，胞漿中央可見圓形細胞核，內見核仁（見圖1）。

圖1 倒置顯微鏡下的ATⅡ（200×）

3.2 SP-A免疫組化鑒定 免疫組化陽性信號為細胞漿內分布均勻的淺褐色顆粒（見圖2）。

圖2 ATⅡSP-A免疫組化鑒定（200×）

3.3 電鏡下形態(tài) 電鏡下可見ATⅡ細胞形狀較規(guī)則，細胞表面有很多長短不一、粗細不等的微絨毛，胞核明顯，胞漿內含有大小不一同心圓或平行排列的板層小體，少數(shù)細胞可以見到板層小體被分泌到細胞外（見圖3）。

3.4 ATⅡ細胞活力和純度 通過IgG免疫黏附純化后的ATⅡ臺盼藍染色顯示細胞活力為95%以上。

通過SP-A免疫組化染色純化染色判定，純化后ATⅡ的純度可達92%。經上述初步鑒定，我們認為本實驗培養(yǎng)的細胞為ATⅡ，且純度、活力足夠，可以用來進行下一步的實驗研究。

圖3 ATⅡ電子顯微鏡鑒定（8 000×）

4 討論

肺泡上皮組織主要由Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞構成，ATⅡ約占60%，其覆蓋面積只占肺泡總面積的4%，細胞為立方形，其特征性結構是胞質中含有大量的板層小體。ATⅡ是肺泡上皮細胞的祖細胞，有增殖能力和定向分化能力。體外培養(yǎng)后變成類似于肺泡Ⅰ型上皮細胞的扁平狀，但這一過程是可逆的。該細胞基本不傳代，并且分離、培養(yǎng)難度較大，不易獲得數(shù)量較多同時還具有較高純度的細胞懸液[9]。曾慶富等[10]報道，大鼠ATⅡ原代培養(yǎng)18～24 h，ATⅡ大量貼壁；36～48 h，細胞平展呈多邊形，形成細胞單層，胞漿內有大量反差明顯的細小顆粒，細胞核明顯；第4 d細胞內顆粒有所減少；第6～7 d顆粒明顯減少，細胞特征無法辨認。體外培養(yǎng)ATⅡ的生化特性變化也快，培養(yǎng)超過24～48 h ATⅡ的卵磷脂和磷酸甘油酯的含量和合成下降。培養(yǎng)24 h內，SP-A和SP-B mRNA減少。因此，ATⅡ在原代培養(yǎng)第24～72 h內處于最佳生長狀態(tài)，此時適合用于體外實驗研究。由于ATⅡ具有特殊的生物學特性，尚不能形成細胞株供研究用，且其分離、純化、鑒定及原代培養(yǎng)的操作較為繁瑣，細胞形態(tài)功能易發(fā)生變化，給研究工作帶來諸多不便。

體內外實驗證明，ATⅡ增生受角質化細胞生長因子的調控[11-12]，能分化為肺泡Ⅰ型細胞，在一定條件下也可逆轉為ATⅡ。因此體外培養(yǎng)的ATⅡ細胞生物學特性仍是穩(wěn)定的。

本實驗發(fā)現(xiàn)，含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液適宜ATⅡ細胞的生長。胰蛋白酶消化時間不宜過長。采用Dobbs等[3]年提出的IgG吸附純化法可以得到純度超過90%的ATⅡ細胞，并可將不需要的Ⅰ型上皮細胞及大多數(shù)成纖維細胞去除。

ATⅡ在光鏡下胞漿內含較多包含體，細胞核明顯。電子顯微鏡下可見到特異性的板層小體，這是鑒定ATⅡ細胞的最直接方法。ATⅡ細胞中SP-A含量最多，用SP-A免疫組化鑒定ATⅡ具有高度的特異性，同時也是一種簡便的敏感方法。因此，電子顯微鏡與SP-A免疫組化結合鑒定ATⅡ可能是一種敏感、特異的鑒定方法。

[1]Mason RJ.Biology of alveolar type II cells[J].Respirology,2006,11 Suppl:S12.

[2]Andreeva AV,Kutuzov MA,Voyno-Yasenetskaya TA.Regulation of surfactant secretion in alveolar type II cells[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293(2):L259.

[3]Dobbs LG,Gonzalez G,Williams MC.An improred method for isolating typeⅡcells in high yield and purity[J].Am Rev Respir Dis,1986,134(1):141.

[4]Corti M,Brody AR,Harrison JH.Isolation and primary culture of murine alveolar TypeⅡcells[J].Am J respir cell Mol Biol,1996,14(4):309.

[5]史雪梅，張惠蘭，熊盛道，等．肺泡Ⅱ型上皮細胞的原代培養(yǎng)及生物學特性比較研究[J].中國病理生理雜志，2008，24(11)：2282.

[6]Dobbs LG,Williams MC,Brandt AE.Changes in biochemical char?acteristics and pattern of lectin binding of alveolar typeⅡcells with time in culture[J].Biochem Biophys Acta,1985,846(1):155.

[7]Chen J,Chen Z,Narasaraju T,et a1.Isolation of highly pure alveolar epitheIial type I and typeⅡcells from rat lungs[J].Lab Invest,2004,84(6):727.

[8]郝嘉，李永旺，肖穎彬．大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞體外培養(yǎng)和鑒定[J].第三軍醫(yī)大學學報,2000,22(5):500.

[9]Gonzalez R,Yang Y H,Griffin C,et a1.Freshly isolated rat alveolar type I cells,typeⅡcells,and cultured typeⅡ cells have distinct molecular phenotypes[J].Am J Physio Lung Cell Mol Physiol,2005,288(1):L179.

[10]曾慶富,蔣海鷹,錢仲裴,等.肺泡Ⅱ型上皮細胞的分離純化及原代培養(yǎng)[J].中華病理學雜志,1998,27(5):384.

[11]Qiao R,Yan W,Clavijo C,et al.Effects of KGF on alveolar epi?thelial cell transdifferentiation are mediated by JNK signaling[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2008,38(2):239.

[12]Isakson BE,Lubman RL,Seedorf GJ,et al.Modulation of pulmo?nary alveolar type II cell phenotype and communication by extra?cellular matrix and KGF[J].Am J Physiol Cell Physiol,2001,281(4):C1291.