何文勝

(福建生物工程職業(yè)學(xué)院生物工程系,福建福州 350002)

0 引 言

胞磷膽堿鈉片為核苷衍生物,是磷脂生物合成的中間產(chǎn)物,存在于所有細(xì)胞中,是磷脂合成的主要輔酶,通過(guò)促進(jìn)卵磷脂的合成而改善腦的功能,表現(xiàn)為意識(shí)狀態(tài)改善、大腦血流量增加及對(duì)氧的攝取明顯提高。通過(guò)增加腦血流量,改善腦代謝和催醒。降低腦血管阻力,增加腦血流而促進(jìn)腦物質(zhì)代謝,改善腦循環(huán)。另外可增強(qiáng)腦干網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上行激活系統(tǒng)的機(jī)能,增強(qiáng)錐體系統(tǒng)的機(jī)能,改善運(yùn)動(dòng)麻痹,故對(duì)促進(jìn)大腦功能的恢復(fù)和促進(jìn)蘇醒有一定作用,用于急性顱腦外傷和腦手術(shù)后意識(shí)障礙。近年來(lái),廣泛應(yīng)用于腦手術(shù)和顱腦外傷所引起的意識(shí)障礙以及其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷引起的功能和意識(shí)障礙、震顫麻痹、耳鳴和神經(jīng)性耳聾及乙醇、安眠藥中毒等。

為了有效控制產(chǎn)品質(zhì)量,保證臨床用藥安全有效,原檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中含量采用紫外分光光度法,有關(guān)物質(zhì)采用薄層色譜法測(cè)定[1]。參見(jiàn)文獻(xiàn)[2-5],文中建立了HPLC法[6-9]測(cè)定胞磷膽堿鈉片有關(guān)物質(zhì)以及含量,方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2010CH T高效液相色譜儀,色譜柱為Grace Smart 4.6 mm ×250 mm 5 μm 。

1.2 試藥

胞磷膽堿鈉片,福建省閩東力捷迅醫(yī)藥有限公司,批號(hào):091001,091002,091003;

胞磷膽堿鈉對(duì)照品,中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào):140675-200602;

磷酸二氫鈉,分析純,汕頭金砂化工廠;

水為超純水;

三乙胺,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

磷酸,分析純,上海三鷹化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與適用性試驗(yàn)

色譜柱為Grace Smart RP C184.6 mm×250 mm 5 μm;以磷酸二氫鈉溶液(取磷酸二氫鈉3.12 g,加水1000 mL溶解,加入三乙胺5 mL,用磷酸調(diào) pH值至 5.0)為流動(dòng)相;流速1.0 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng) 271 nm,進(jìn)樣量20 μL。供試品溶液測(cè)定色譜圖中,按胞磷膽堿鈉的主峰計(jì)算,理論板數(shù)為7571,分離度為7.6。

2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

2.2.1 專屬性

精密稱取經(jīng)強(qiáng)光照射(4500 lx±500 lx)、高濕(90%RH ±5%RH,5 d)、高溫(90 ℃,24 h)加速破壞的樣品細(xì)粉約32 mg置于50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。濾過(guò),照上述選定的方法測(cè)定,結(jié)果表明,用上述方法加速破壞后測(cè)定結(jié)果均無(wú)明顯變化。

精密稱取輔料細(xì)粉約32 mg置于50 mL,加流動(dòng)相稀釋至刻度,依法測(cè)定,結(jié)果表明,輔料對(duì)胞磷膽堿鈉的測(cè)定無(wú)干擾。

2.2.2 定量限

取有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的對(duì)照溶液用流動(dòng)相稀釋10倍。按上述色譜條件測(cè)定,記錄色譜圖,信噪比S/N＞10。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

分別取有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的供試品溶液與對(duì)照溶液,于室溫下放置,按上述選定的方法,在0,2,4,6,8 h分別進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果供試品溶液的色譜圖中雜質(zhì)百分含量的RSD=2.98%,表明本品在室溫下放置8 h內(nèi)穩(wěn)定,見(jiàn)表1。

表1 胞磷膽堿鈉片有關(guān)物質(zhì)穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.4 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

精密稱取本品細(xì)粉32 mg,置于50 mL容量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液作為供試品溶液。精密量取供試品溶液2 mL于100 mL的容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液。照上述選定的色譜條件試驗(yàn),取對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀。結(jié)果表明,各雜質(zhì)含量均小于1.0%,見(jiàn)表2。

表2 胞磷膽堿鈉片有關(guān)物質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 專屬性

精密稱取輔料空白細(xì)粉約32 mg置于50 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。濾過(guò),精密量取續(xù)濾液2 mL置10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,照含量測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定,結(jié)果表明,輔料對(duì)胞磷膽堿鈉含量測(cè)定無(wú)干擾。

2.3.2 耐用性

另?yè)Q一根色譜柱 Thermo ODS-2 HYPERSIL 4.6×250 nm柱對(duì)同一份樣品溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn),柱效良好,結(jié)果表明,該色譜系統(tǒng)在兩根色譜柱上表現(xiàn)無(wú)明顯差別。

2.3.3 線性關(guān)系

精密稱取胞磷膽堿鈉對(duì)照品約 16 mg置200 mL量瓶中,用適量流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,分別精密量取 5,10,15,20,25,30,50 μL進(jìn)樣。按上述選定的條件測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μ g)為橫坐標(biāo),以峰面積A為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,回歸方程為:A=549471C+6613.3,r=0.99996。結(jié)果表明,胞磷膽堿鈉在0.403～4.03 μ g范圍內(nèi)與峰面積成良好的線性關(guān)系,見(jiàn)表3和圖1所示。

表3 胞磷膽堿鈉片含量測(cè)定線性試驗(yàn)

圖1 胞磷膽堿鈉片線性圖

圖中

2.3.4 胞磷膽堿鈉片回收率試驗(yàn)

精密稱取胞磷膽堿鈉對(duì)照品約8 mg,10 mg,12 mg(各3份),同時(shí)精密稱取按處方比例的空白輔料適量于25 mL量瓶中,加流動(dòng)相少許使其溶解,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻;濾過(guò),精密量取續(xù)濾液2 mL置于10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣 20 μL,記錄色譜圖,結(jié)果平均回收率為100.2%,RSD為0.98%,見(jiàn)表4。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取本品一批(批號(hào):09001-1)約32 mg 6份,按含量測(cè)定項(xiàng)下方法配制,按上述選定的條件測(cè)定,結(jié)果平均含量為 96.87%,RSD=0.62%,結(jié)果表明重復(fù)性良好,見(jiàn)表5。

表4 胞磷膽堿鈉片含量測(cè)定回收率試驗(yàn)

表5 胞磷膽堿鈉片重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

2.3.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液一份于室溫下放置,按上述選定的方法,在0,2,4,6,8 h分別進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果以峰面積計(jì)RSD為0.21%。結(jié)果表明,樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定,見(jiàn)表6。

表6 胞磷膽堿鈉片含量測(cè)定穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.3.7 樣品含量測(cè)定

2.3.7.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取以五氧化二磷為干燥劑,在100℃減壓干燥5 h的胞磷膽堿鈉對(duì)照品16 mg兩份分別置于200 mL的容量瓶中,加流動(dòng)相磷酸二氫鈉溶液適量,搖勻使溶解,加流動(dòng)相至刻度。

2.3.7.2 供試品溶液的配制

取本品10片,研細(xì),精密稱取細(xì)粉約32 mg(約相當(dāng)于胞磷膽堿鈉20 mg),置于50 mL量瓶中,加流動(dòng)相磷酸二氫鈉溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過(guò);精密量取續(xù)濾液2.0 mL,置于10 mL容量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。

照上述選定的方法分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果平均含量分別為96.10%,96.60%,95.80%,見(jiàn)表7和圖2所示。

表7 胞磷膽堿鈉片含量測(cè)定試驗(yàn)

圖2 胞磷膽堿鈉片含量測(cè)定HPLC圖

3 結(jié) 語(yǔ)

1)檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取胞磷膽堿鈉對(duì)照液及其輔料空白液在350～230 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)作紫外光譜掃描,對(duì)照液在271 nm波長(zhǎng)處有最大吸收,而輔料空白液在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)漸近無(wú)吸收,故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm。

2)高效液相色譜儀測(cè)定胞磷膽堿鈉含量曾選用不同比例的甲醇-水為流動(dòng)相,但胞磷膽堿鈉保留時(shí)間太短,理論板數(shù)不夠理想,經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)和試驗(yàn),最終采用0.025 mol/L磷酸二氫鈉水溶液為流動(dòng)相。

3)所測(cè)物質(zhì)均為堿性物質(zhì),采用中性流動(dòng)相(水或水-甲醇)均無(wú)法達(dá)到較好分離,采用偏酸性的磷酸鹽緩沖液作為流動(dòng)相,改善了拖尾現(xiàn)象,得到了較好分離。

4)通過(guò)對(duì)胞磷膽堿鈉片進(jìn)行高溫、高濕、光照條件下的加速破壞研究,結(jié)果表明,無(wú)新的雜質(zhì)產(chǎn)生,主峰與雜質(zhì)峰分離度良好。

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