楊柯 張京玲 黃謙 王義善

（1濱州醫(yī)學(xué)院 山東煙臺(tái)264003；2山東省巨野縣人民醫(yī)院 巨野274900；3中國人民解放軍第107醫(yī)院腫瘤中心 煙臺(tái)264002）

中藥狼毒大戟為大戟科植物狼毒大戟的根，早在幾千年以前就有記載，具有散結(jié)、逐水、止痛、殺蟲的療效。長期臨床研究發(fā)現(xiàn)狼毒具有較好的抗腫瘤作用，且能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)旨在探討狼毒大戟誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人A549細(xì)胞凋亡的作用，以期為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥狼毒水提液由中國人民解放軍第107醫(yī)院腫瘤實(shí)驗(yàn)中心配置，取得濟(jì)南軍區(qū)制劑許可（濟(jì)聯(lián)制字2000BM08046）；非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均購自Gibco公司；Annexin-V FITC/PI雙染試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自BD公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，于溫度為37℃、5%CO2的飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 分組 將對數(shù)生長期的細(xì)胞傳代分組，分別為空白組、狼毒組（0.8 mg/mL），每組三個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁后給予藥物干預(yù)，繼續(xù)常溫培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 離心收集狼毒組和空白組培養(yǎng)24 h的人A549細(xì)胞，2 000 rpm離心5 min，棄培養(yǎng)基。用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次2 000 rpm離心5 min。用400 μL Annexin V結(jié)合懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106cells/mL。在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin V FITC染色液，輕輕混勻后于2～8℃避光條件下孵育15 min。加入 10 μL PI染色液后輕輕混勻，于 2～8 ℃避光條件下孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

1.5 熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞 滴1滴Annexin-V FITC/PI染色后的細(xì)胞于載玻片上，蓋玻片封片，倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 狼毒對人A549細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，狼毒大戟可以較明顯地促進(jìn)人A549細(xì)胞的凋亡，空白組凋亡率為0.3%，狼毒組凋亡率為34.1%。

2.2 熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞 倒置熒光顯微鏡下觀察，狼毒組凋亡細(xì)胞明顯多于空白組。

3 討論

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，在歐美國家非小細(xì)胞肺癌占肺癌發(fā)病率的70%，并呈逐年上升趨勢。肺癌的治療以放化療為主，但其毒副作用較大，嚴(yán)重影響腫瘤患者生活質(zhì)量，且常加快腫瘤的轉(zhuǎn)移。隨著中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中西醫(yī)結(jié)合治療腫瘤已經(jīng)廣泛用于臨床，醫(yī)學(xué)界也出現(xiàn)了以補(bǔ)充替代為醫(yī)療目的的研究[1]。中醫(yī)治療不僅能控制腫瘤發(fā)展還能提高機(jī)體免疫力，臨床研究發(fā)現(xiàn)[2～5]中藥狼毒在控制腫瘤發(fā)展、提高患者生活質(zhì)量上顯示了重要作用。Wang L等[6]研究發(fā)現(xiàn)狼毒大戟能顯著抑制黑色素瘤的增殖并促進(jìn)IL-2的表達(dá)。這些研究充分顯示了中藥狼毒在治療腫瘤方面的多靶點(diǎn)雙向調(diào)節(jié)作用。狼毒雖然前景廣闊，但是關(guān)于狼毒抗腫瘤作用機(jī)制及有效單體成分，亟待深入研究。

[1]Sankaranarayanan A,NarenderT,KumarS,etal.Alliumsativum constituents:effect on free radical generation from rat neutrophils[J].Cell Mol Biol(Noisylegrand),2007,53(5):63-67

[2]王義善,鄭秋生,賈喜風(fēng),等.狼毒抑制降低癌細(xì)胞惡性表型小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移及彗星電泳實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)雜志,2007,8(1):1-3

[3]王義善,鄭秋生,姜鵬,等.狼毒水提液抗腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華醫(yī)學(xué)進(jìn)展雜志,2006,4(6):1

[4]王義善.中藥灌注RF加溫IMCRT內(nèi)外治法于臨床腫瘤應(yīng)用研究[J].中華藥學(xué)與臨床,2007,3(3):1

[5]韓麗英,陳楓,張玉高,等.大蒜素對K562細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].臨床血液學(xué)雜志,2006,19(4):2

[6]Wang L,Duan H,Wang Y,et al.Inhibitory effects of Lang-du extract on the in vitro and in vivo growth of melanoma cells and its molecular mechanisms of action [J].Cytotechnology,2010,62(4):357-366