王文俊，畢江華，仝太軍

（1.新疆阿勒泰市哈巴河縣薩爾塔木鄉(xiāng)獸醫(yī)站 836702；2.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心 100107）

淺淡我國(guó)改變牛性別比例技術(shù)的研究概況

王文俊1，畢江華2，仝太軍2

（1.新疆阿勒泰市哈巴河縣薩爾塔木鄉(xiāng)獸醫(yī)站 836702；2.北京安伯胚胎生物技術(shù)中心 100107）

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，人們常常期望得到某一特定性別的家畜。如在奶牛場(chǎng)，生產(chǎn)者希望母牛所生的犢牛全是雌性，給牛場(chǎng)帶來更高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，在自然狀態(tài)下，動(dòng)物的性比總是遵循公母1∶1的規(guī)律，始終保持平衡，如何打破自然界的性比規(guī)律，獲得理想的公母比例有很重要的意義。為此，人們嘗試了很多種方法對(duì)動(dòng)物性別進(jìn)行控制。本文對(duì)此進(jìn)行綜述，以期對(duì)畜牧生產(chǎn)有所幫助。

1 性別控制概況

目前，性別控制技術(shù)主要有三大類：（1）通過對(duì)X、Y精子的分離，結(jié)合人工授精，控制后代性別；（2）對(duì)早期胚胎進(jìn)行鑒定，結(jié)合胚胎移植技術(shù)；（3）調(diào)控受精環(huán)境技術(shù)。由于X、Y精子分離技術(shù)的相關(guān)研究報(bào)道很多，因此，本文將重點(diǎn)比較和討論后兩類中的常用技術(shù)在性別控制中的應(yīng)用概況。

1.1 早期胚胎的性別鑒定

應(yīng)用于哺乳動(dòng)物早期胚胎性別鑒定的方法主要有：細(xì)胞遺傳學(xué)方法、生物化學(xué)微量分析法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。應(yīng)用分子生物學(xué)法中的PCR擴(kuò)增法是一種比較理想和可靠的鑒定方法。采用PCR擴(kuò)增對(duì)胚胎進(jìn)行性別鑒定，同時(shí)結(jié)合胚胎冷凍保存、胚胎移植等配套技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)家畜的性別控制，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于牛胚胎產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。

自1990年英國(guó)學(xué)者Sinclair等[1]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物Y染色體短臂上存在性別決定區(qū)（Sex Determining Region of the Y chromosome，SRY）以來，許多學(xué)者在這方面進(jìn)行了深入的研究。PCR法（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）的實(shí)質(zhì)就是Y染色體特異性片段或Y染色體上的性別決定基因（SRY）的檢測(cè)技術(shù)，即通過合成SRY基因或其它Y染色體上的特異性片段的部分序列作為引物，用少部分胚胎細(xì)胞中的DNA為模板，在一定條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能擴(kuò)增出目標(biāo)片段的胚胎為雄性胚胎，否則為雌性胚胎[2]。目前常用的牛胚胎性別鑒定的PCR方法主要有兩種：一種為常規(guī)PCR，即用一對(duì)Y-染色體特異性引物或同時(shí)使用一對(duì)公、母牛共有基因引物作為內(nèi)標(biāo)引物對(duì)胚胎樣品進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增來鑒定胚胎性別；另一種為巢式PCR，即先用Y-染色體特異基因的外引物和內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行第1次PCR擴(kuò)增，然后取第1次擴(kuò)增產(chǎn)物再加入內(nèi)引物和內(nèi)標(biāo)引物進(jìn)行第2次擴(kuò)增。

我國(guó)曾溢滔等[3]于1993年首先用DNA測(cè)序直接檢測(cè)到牛SRY基因的核心序列，同時(shí)設(shè)計(jì)合成僅特異于牛SRY基因的2對(duì)PCR寡核苷引物，對(duì)17枚奶牛胚胎用不同的引物2次擴(kuò)增進(jìn)行性別鑒定，性別符合率為100%；鑒定后有4枚胚胎移植成功，其產(chǎn)犢結(jié)果均與胚胎性別鑒定結(jié)果相符合。1994年，羅應(yīng)榮等[4]用所設(shè)計(jì)的引物，對(duì)10頭奶牛血液樣品和胚胎細(xì)胞中染色體擴(kuò)增，結(jié)果表明擴(kuò)增對(duì)已知性別的牛血液樣品和同一胚胎的不同樣品結(jié)果完全符合；在奶牛場(chǎng)采集新鮮胚胎，用玻璃針法切取數(shù)個(gè)細(xì)胞，用PCR方法鑒定后移植，有7頭犢牛出生，其性別與PCR鑒定結(jié)果完全一致。隨后，胡明信[5]，楊建明[6]，呂碧文[7]等也進(jìn)行了這方面的研究，獲得了較高的準(zhǔn)確率。2003年，陳從英[8]等根據(jù)牛SRY基因自行設(shè)計(jì)引物分別用常規(guī)PCR和巢式PCR對(duì)牛早期胚胎進(jìn)行性別鑒定，其鑒定結(jié)果與實(shí)際完全一致。但是這種傳統(tǒng)的PCR性別鑒定，從設(shè)計(jì)引物到提取胚胎細(xì)胞的DNA再到擴(kuò)增，其耗時(shí)長(zhǎng)、易污染、取樣方法對(duì)胚胎移植妊娠率也造成了很大的影響。因此，研究人員通過不斷尋找適合的牛雄性特異性引物，探索活檢細(xì)胞的數(shù)量，縮短性別鑒定所需的時(shí)間等方面進(jìn)行研究來解決其在實(shí)際生產(chǎn)中的可用性。朱化彬[9]，洪桂云[10]，張莉[11]等針對(duì)傳統(tǒng)PCR的缺陷，通過研究?jī)?yōu)化胚胎DNA擴(kuò)增條件和PCR性別鑒定技術(shù)體系，提高了整個(gè)性別鑒別時(shí)間，并且保證了鑒定可靠性。但到目前為止，國(guó)內(nèi)的PCR性別鑒定技術(shù)往往只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，PCR性別鑒定試劑盒并未能進(jìn)行商品化生產(chǎn)，這極大地限制了其在畜牧業(yè)上的應(yīng)用。李樹靜等[12]利用胚胎切割儀和倒置顯微鏡對(duì)85枚胚胎取樣，將樣品置于液氮后，應(yīng)用美國(guó)AB Technology公司提供的專利產(chǎn)品YCD（Y-chromosomal Determinant）試劑盒，用 PCR 技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，鑒定出52枚雌性胚胎后移植，產(chǎn)28個(gè)母犢，產(chǎn)犢率52.7%，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到100%；移植180枚非鑒定胚胎，產(chǎn)犢率52.7%，與取樣后胚胎的產(chǎn)犢率無顯著差異。此次PCR胚胎性別鑒定技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用模式初探為我國(guó)牛胚胎移植技術(shù)應(yīng)用于奶牛純繁提供了平臺(tái)。

1.2 調(diào)控受精環(huán)境技術(shù)

染色體理論并非性別決定機(jī)制的全部，外部環(huán)境中的某些因素也是性別決定機(jī)制的重要條件。

1.2.1 控制輸精時(shí)間 由于Y精子的游速快于X精子，如果提早（排卵前）輸精，Y先期到達(dá)受精部位，等到卵子到達(dá)時(shí)，Y精子已接近失活；相反，X精子運(yùn)動(dòng)慢，且壽命長(zhǎng)，在這時(shí)X精子活力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Y精子，有利于X精子與卵子的結(jié)合，提高產(chǎn)母犢率。陳元明[13]試驗(yàn)證明，適時(shí)授精性控法能使產(chǎn)犢牛的性別與授精當(dāng)時(shí)預(yù)測(cè)子代牛性別的符合率達(dá)到約70.8%。畢江華等[14]報(bào)道，在超排處理供體奶牛發(fā)情后8～11 h，12～15 h和16～19 h采用常規(guī)凍精法第1次配種，12 h后第2次配種，獲取胚胎后采用PCR法鑒定，16～19 h組雌性胚率最低為45.2%，8～11 h組和12～15 h組分別為47.0%和48.6%，3組間雌性胚率差異不顯著，但隨著輸精時(shí)間的推遲，雌性率下降。

1.2.2 調(diào)整子宮頸內(nèi)黏液的pH值 Y精子對(duì)酸性環(huán)境的耐受力比X精子差，當(dāng)母牛生殖道內(nèi)的pH值較低時(shí)，Y精子的活力減弱，失去較多的與卵子結(jié)合的機(jī)會(huì)，故后代雌性較多。李秀山等[15]對(duì)實(shí)驗(yàn)組正常發(fā)情的奶牛在輸精前15～20 min向子宮頸內(nèi)3 cm處輸入1 mL 5%精氨酸制劑，產(chǎn)犢46頭，其中母犢34頭，母犢率為73.9%。胡春山等[16]用兩年多的時(shí)間（1986～1987）重復(fù)應(yīng)用5%精氨酸溶液控性輸精試驗(yàn)，產(chǎn)母犢率分別為72.22%和55.55%。王光輝等[17]用5%L型精氨酸注入母牛子宮內(nèi)，并對(duì)母牛的生母率和子宮頸內(nèi)黏液的pH值進(jìn)了測(cè)定。結(jié)果表明，子宮頸黏液pH值在7.16±0.28、8.06±0.32和7.76±0.52時(shí)，生母率分別為78.5%、18.75%和47.90%。精氨酸處理的奶牛兩年的生母率平均為63.8%，比對(duì)照組提高15.8%，差異極顯著。謝獻(xiàn)勝等[18]向隨機(jī)分組的268頭發(fā)情奶牛子宮內(nèi)上1/3處分別注入5%和8%的精氨酸1 mL，分別在15 min和20～30 min后給母牛輸精，其中，5%精氨酸處理、20～30 min后輸精的試驗(yàn)組，母牛產(chǎn)雌犢的比率達(dá)73.77%，比對(duì)照組提高25.46個(gè)百分點(diǎn)，差異極顯著。張永春等[19]采用3種濃度（4.5%、5.5%和6.5%）的精氨酸對(duì)108頭奶牛進(jìn)行產(chǎn)母犢率試驗(yàn)，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組比對(duì)照組提高8.9%～13.34%，以5.5%精氨酸濃度最為明顯，兩者差異顯著，而試驗(yàn)組之間差異不顯著。

2 總結(jié)

2.1 PCR性別鑒定和胚胎移植技術(shù)為提高優(yōu)秀母畜繁殖力提供了有利的保障，已經(jīng)開始在我國(guó)應(yīng)用。目前國(guó)內(nèi)商業(yè)化應(yīng)用采用的是進(jìn)口PCR鑒定試劑盒，由于其售價(jià)太高，限制了該技術(shù)的普及，因此研制自主產(chǎn)權(quán)的性別鑒定試劑盒已迫在眉睫。

2.2 應(yīng)用PCR性別鑒定技術(shù)，胚胎切割取樣是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，但目前國(guó)內(nèi)掌握此項(xiàng)技術(shù)的人員數(shù)目有限，因此，加強(qiáng)培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)熟練人員已成必要。

2.3 通過控制牛的受精環(huán)境來實(shí)現(xiàn)性別控制雖然有一定的效果，但其重復(fù)性太差，因此對(duì)該法的推廣應(yīng)用價(jià)值仍有爭(zhēng)議。

［1］Sinclair，Berta，Palmer，etal.A genefrom thehuman sex-determiningregion encodes a protein with homologytoa conserved DNA-binding motif[J].Nature，1990，346:240-244.

［2］桑潤(rùn)滋.動(dòng)物繁殖生物技術(shù)（第2版）[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006，352.

［3］曾溢滔，張美蘭，胡明信，等.應(yīng)用PCR擴(kuò)增牛SRY序列進(jìn)行奶牛胚胎性別鑒定 [J]． 中國(guó)科學(xué)，（B），199323（4）：371-375．

［4］羅應(yīng)榮，劉云海，朱化彬，等.應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)鑒定奶牛胚胎性別和移植實(shí)試驗(yàn) [J].中國(guó)畜牧雜志，1994.30（2）：32-37.

［5］胡明信，吳學(xué)清，高建明，等．牛胚胎性別鑒定與取樣胚胎移植應(yīng)用技術(shù)的研究 [J]． 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1995，26（6）：487-495．

［6］楊建明，譚麗玲，宮云浩，等．PCR方法用于奶牛早期胚胎的性別鑒定[J]．遺傳，1995，17（2）：14-16．

［7］呂碧文，俞頌東，金水仙．牛早期胚胎性別鑒定的PCR方法研究 [J]． 武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1999，45（2）：211-214．

［8］陳從英，黃路生，陳靜波，等.牛早期胚胎性別鑒定PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化研究 [J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2003，，34（3）：209-212.

［9］朱化彬，王棟，程金華，等.牛早期胚胎性別快速鑒別的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（12）：1270-1274.

［10］洪桂云，陳宏權(quán).哺乳動(dòng)物胚胎性別鑒定試劑盒的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（1）：19-21.

［11］張莉，史愛華，李桂萍，等.牛早期胚胎性別鑒定PCR方法的研究[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2009，24（1）：212-214.

［12］李樹靜，余文莉，劉玲，等.牛PCR胚胎性別鑒定技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用模式初探[D].中國(guó)奶業(yè)協(xié)會(huì)第十八次繁殖技術(shù)研討會(huì)論文集，2003（8）：66-71.

［13］陳元明.我國(guó)牛性別控制研究概況及驗(yàn)證性試驗(yàn)[J].中國(guó)奶牛，1992（2）：62-64.

［14］畢江華，李樹靜，馮春濤，等.常規(guī)凍精輸精時(shí)間對(duì)奶牛胚胎質(zhì)量和性別比例的影響[J].2009，45（17）：23-24.

［15］李秀山，楊效濟(jì)，姜洗武，等.用精氨酸提高奶牛繁殖母犢比例初探[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1988，2：17.

［16］胡春山，鄭昌樂，王志蘭，等.應(yīng)用5%精氨酸溶液對(duì)奶牛控性輸精試驗(yàn)中得到的啟示 [J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1989，2：1-2.

［17］王光輝，劉海廣.精氨酸對(duì)奶牛性別的影響 [J].中國(guó)奶牛2000，3，36-37.

［18］謝獻(xiàn)勝，仲崇懷，蔣春茂，等.精氨酸對(duì)奶牛后代性別控制的試驗(yàn)[J].畜牧與獸醫(yī)，2003，35（12）：19-20.

［19］張永春，魯金波，朱曉華，等.精氨酸對(duì)奶牛產(chǎn)雌率的影響[J].內(nèi)蒙古民族大學(xué)學(xué)報(bào) （自然科學(xué)版），2009，24（6）：657-658.

S823.3

B

1005-2739（2011）01-0034-03

2010-10-27