馬群飛 林 堅

福建省疾病預防控制中心

國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局和國家標準化管理委員會于2008年12月29日公布的GB/T 8538－2008《飲用天然礦泉水檢驗方法》（以下簡稱新國標），于2009年4月1日起正式實施。新國標實施一年后，我們根據連續(xù)多年監(jiān)測飲用天然礦泉水水源及其瓶裝產品的經驗，結合實際應用情況，對新國標中存在的微生物學問題進行探討，完善、增強標準的可操作性，并為新國標的再次修訂提供參考依據。

總則

在新國標4.1.7規(guī)定“計算結果除色度、渾濁度以兩位有效數(shù)字表示外，其他指標均以三位有效數(shù)字表示。”不僅對微生物學檢驗來說，即使是其他的理化檢驗，這樣規(guī)定也是不切合實際的。實際上，在新國標中，多處都出現(xiàn)了不符合這個規(guī)定的書寫方式。新國標4.1.8檢驗方法的選擇規(guī)定，“同一個項目如果有兩個或兩個以上的檢驗方法時，可根據設備及技術條件選擇使用，但第一法為仲裁法。”在新國標4.52大腸菌群檢驗方法中，第一法多管發(fā)酵法是估計概率方法，可信度不高。從檢驗精度來說，第一法最低檢出限為2 MPN/100mL（除標準制定者憑空想象的0 MPN/100mL外），無法滿足GB 8537－2008《飲用天然礦泉水》對于大腸菌群定量的要求（主要限量值分別為0、1、2 MPN/100mL），只有第二法濾膜法（直接培養(yǎng)計數(shù)法）才可以報告這樣的精度。因此，只有第二法才可以作為仲裁方法。在強制性國家標準GB 4789.1－2010《國家食品安全標準 食品微生物學檢驗 總則》也是明確“食品微生物檢驗方法標準中對同一檢驗項目有兩個及兩個以上定量檢驗方法時，應以平板計數(shù)法為基準方法”。考慮到礦泉水的包裝產品屬于食品的飲料類別，按照《中華人民共和國食品安全法》的要求，應執(zhí)行相應的強制性標準。所以，建議在日常工作中，應慎重執(zhí)行新國標4.1.8的規(guī)定，避免導致法律上的糾紛。另外，按照GB 19489－2008《實驗室生物安全通用要求》，所有進行致病微生物檢驗的單位，必須建立二級生物安全實驗室，相應檢驗機構也都應該按照此標準執(zhí)行。

采集和保存

新國標表4規(guī)定，微生物學檢驗項目的采樣容器材質為硼硅玻璃。在4.2.2.2.4要求最好采用具塞廣口瓶。在實際工作中我們發(fā)現(xiàn)，加熱滅菌很容易導致具塞玻璃廣口瓶的瓶口破裂，損耗率非常大。建議使用耐高壓的聚乙烯或者聚丙烯塑料材質的具塞廣口瓶。標準沒有對水源的微生物學采樣方法進行要求。目前，監(jiān)督抽樣和樣品檢驗工作常常分別由不同的單位完成，如何正確進行無菌采樣，更成為不可忽略的問題，標準應對此明確規(guī)定。表4規(guī)定的微生物學測定項目為“菌落總數(shù)、大腸菌群”，與標準后續(xù)的檢驗項目完全不配套，是一個典型的疏忽。采樣數(shù)量使用“體積/mL”表示，也不符合國家標準的書寫規(guī)定，建議書寫為“體積/（mL）”。表4規(guī)定微生物學測定采集500mL水樣，也無法滿足后續(xù)檢驗方法的要求。因為單單進行一次的四項微生物學指標檢驗，至少需要600mL（50＋250＋250＋50）水樣，更是遠遠無法滿足可能進行的第二次檢驗的樣品需要量。對于樣品保藏處理技術，標準規(guī)定了6h的冷藏保存時間。但是在GB/T 5750.2－2006《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集與保存》中，規(guī)定0～4 ℃冷藏保存時間為4h，兩個相近的標準規(guī)定差距明顯。另外，表4規(guī)定的冷藏溫度為2 ℃～5 ℃，而后續(xù)的微生物學檢驗使用的儀器要求使用0 ℃～8 ℃冰箱，冷藏保存的培養(yǎng)基則要求2 ℃～8 ℃保存，對于溫度控制的描述顯得過于隨意。

大腸菌群

新國標沿用了GB/T 8538－1995的多管發(fā)酵法和濾膜法，未加修改，所以仍然存在原標準的一些缺陷，如未說明MPN（Most Probable Number，最可能數(shù)）的含義、多管發(fā)酵全陰性結果時以0 MPN/100mL作為結果直接報告偏差過大、濾膜法未設定平行檢驗或質量控制要求等。圖10最后缺少了一個進行“MPN計數(shù)報告”的流程框圖。鑒于第一法檢驗靈敏度無法滿足實際工作的要求，操作程序也比較繁瑣，可考慮采用定性檢驗方法，直接在100mL雙料乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基中加入100mL水樣，根據是否發(fā)酵產氣來判斷，最為經濟省事。另外，在表32應該增加備注，明確當出現(xiàn)005、055這樣的結果時，該如何核查實驗過程。畢竟這些異常數(shù)值的出現(xiàn)，不應該直接作為最終的結果報告。在4.52.2.5.3應明確在培養(yǎng)后“觀察濾膜上面的菌落特征?！痹?.52.2.5.5之前應明確 “挑取不少于3個（不足3個則全挑）可疑菌落，進行革蘭氏染色鏡檢觀察”，否則前后文句不對應。計算公式（115）建議修改為“確證的大腸菌群菌落數(shù)（CFU）×100÷過濾的樣品量（mL）”。本標準其他的檢驗項目都附加了質量控制的要求，建議在大腸菌群的檢驗中，也附加相應的內容。

糞鏈球菌

新國標4.53.2原理中對于確證實驗，漏掉了對于膽汁液態(tài)培養(yǎng)基生長的要求。實際上，新國標微生物學檢驗部分的原理描述完全是步驟的敘述，沒有真正描述檢驗原理。4.53.5.2.3中未明確應該如何挑選可疑菌落進行證實試驗。建議描述為“挑取不少于5個（不足5個則全挑）可疑菌落，進行革蘭氏染色，糞鏈球菌應為革蘭氏染色陽性球菌，常排列成短鏈狀。根據菌落特征符合情況計數(shù)每250mL水樣中的典型菌落數(shù)”。4.53.5.3.2的過氧化氫酶試驗應該描述為“加幾滴3%過氧化氫溶液到載玻片的涂抹菌苔上，”因為使用“菌液”來描述“菌苔”不恰當。4.53.5.3.3的膽汁液態(tài)培養(yǎng)基使用無菌的100g/L牛膽液，不符合實際工作的需要，建議修改為“100 g/L牛膽鹽溶液”。4.53.5.3.4中要求“若菌落能夠生長繁殖 ”，因為使用的都是液態(tài)培養(yǎng)基，不可能出現(xiàn)菌落，所以建議刪除“菌落”兩字。4.53.7質量保證（包括其他致病菌項目）使用了大腸埃希氏菌ATCC 25922作為陰性對照菌株，從實驗室質量管理的要求來說，應該使用生化特性接近的非特異性菌株。對于糞鏈球菌Fecal streptococcus的英文名稱，不能當作拉丁文學名排成斜體，標準應該直接使用拉丁文學名Enterococcus faecalis這樣規(guī)范的書寫方式。

銅綠假單胞菌

新國標4.54.2原理最后“經證實為銅綠假單胞菌，則其檢測結果為陽性”這句話，屬于典型的因果關系倒置，建議描述為“檢測結果均為陽性者，確證為銅綠假單胞菌?！睂τ谝阴０防迷囼灢捎谩耙阴０啡鉁保瑢嶋H上該培養(yǎng)基不能稱為肉湯，建議稱為乙酰胺液體培養(yǎng)基或者乙酰胺利用培養(yǎng)基。該試驗還要求使用含汞的鈉氏試劑，增加了實驗室廢物排放的負擔。對于乙酰胺利用試驗，多種產品的檢驗方法國家標準都有很好的替代手段，可以考慮等效采用。從滿足實驗需要并保護操作者健康角度考慮，對于紫外燈的功率，應建議限制在8w以下。在圖12檢驗程序里，產熒光（非藍/綠色）菌落和紅褐色菌落的框格下面，建議分別增加一個向下的箭頭，否則看不清檢驗流程。因為4.54.5.4結果觀察、4.54.5.5確證性試驗和4.54.5.6計數(shù)的操作順序前后交叉，多種專業(yè)術語描述混亂，建議合并?！皩⑵渌屑t褐色不發(fā)熒光的菌落進行氧化酶測試、乙酰胺肉湯、金氏B培養(yǎng)基確證性試驗，培養(yǎng)20 h～24 h觀察結果，防止因為培養(yǎng)40 h～48 h導致菌落過分生長而出現(xiàn)菌落融合?！边@樣的描述明顯不準確。建議從這里開始修改為“挑取其他所有不發(fā)熒光的菌落劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)20 h～24 h，進行氧化酶、乙酰胺利用、金氏B培養(yǎng)基產生熒光試驗”，之后分別描述各確證性試驗的操作方法，最后按照公式（116）進行計算。這樣的修改，可以避免漏檢那些完全沒有色素產生的目標菌。4.54.5.6中“注：最初濾膜上顯熒光的菌落經氧化酶反應均呈陽性，因此不需在這個測試中計數(shù)（見表35）?！苯ㄗh整句刪除，因為新國標里不存在表35，而這句話也是前言不搭后語。4.54.6“計算菌落數(shù)時應考慮到驗證試驗的比例及特定的水量，如礦泉水、泉水和其他瓶裝水 ”，也屬于病句，而且本標準不需要考慮除礦泉水之外的其他泉水和其他瓶裝水，建議修改為“計算菌落數(shù)時應考慮驗證試驗的結果及過濾的水量”。公式（116）中F應表達為“產生熒光的非藍綠色菌落數(shù)”，如果沒有排除藍綠色菌落，很可能將導致結果偏高。建議在4.54.9質量保證中增加生化特性接近的熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）作為非特異性菌株。

產氣莢膜梭菌

新國標4.55.3.1要求配制庖肉培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在標準全文中沒有用到，建議刪除。4.55.3.6.2和4.55.3.9.1中描述“本培養(yǎng)基應新鮮設備”、“對氨基酸苯磺酸”，明顯屬于筆誤，應該是新鮮制備和對氨基苯磺酸。對于“校正pH＝7.4”之類的描述，因為與其他微生物學檢驗項目不統(tǒng)一，建議刪除所有的“＝”。這個方法的最大疑惑在于其他微生物學檢驗采用的濾膜孔徑都是0.45μm，而產氣莢膜梭菌是其中體型最粗大的微生物，卻要求使用0.22μm孔徑的濾膜，完全沒有必要。建議統(tǒng)一使用0.45μm孔徑的濾膜，有利于工作的開展。4.55.4.5要求配置的漩渦振蕩器全文沒有使用到，建議刪除。4.55.4.6規(guī)定使用常溫催化或堿性焦性沒食子酸除氧式來滿足厭氧培養(yǎng)需要，但是就我們的實際工作經驗，這樣的簡易厭氧培養(yǎng)裝置，常常導致目標菌無法形成真正黑色的菌落而漏檢。建議盡可能使用厭氧培養(yǎng)箱，如果使用簡易厭氧培養(yǎng)裝置，對于灰白色菌落也要進行確證性試驗，避免漏檢。4.55.6質量保證也使用了大腸埃希氏菌作為陰性對照，應該選擇生化特性接近的厭氧菌，才能真正滿足質量控制的需要。

菌落總數(shù)

新國標將菌落總數(shù)檢驗方法歸入資料性附錄B，但原理說明是經培養(yǎng)后所得1mL水樣中所含“菌落”的總數(shù)，只包括一群嗜中溫的需氧的細菌菌落總數(shù)。應該描述為“1mL水樣經培養(yǎng)后，一群嗜中溫的需氧和兼性厭氧菌形成菌落的數(shù)量”。B.4.5.1.1“每次檢驗時應作一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照”。按照質量控制的慣例，空白對照肯定需要加入1ml稀釋液，而不能僅僅傾注營養(yǎng)瓊脂。建議實際操作中同時加入稀釋液作為空白。新國標將培養(yǎng)時間從原來的24 h修改為48 h，但是前言沒有提及，導致不少基層單位在申報實驗室資質認定的標準變更時認為“方法無變化”，而沒有進行相應的方法確認工作。B.4.5.1.2又出現(xiàn)了“細菌總數(shù)”這個早已淘汰的術語，可能也是標準制定者的疏忽。在B.4.5.2.3要求“以下操作同生活飲用水的檢驗步驟”，而新國標沒有引用GB/T 5750.12－2006《生活飲用水標準檢驗方法微生物指標》，這樣的描述不符合國家標準的書寫規(guī)范。B.4.7.7要求“菌落數(shù)在100以內按實有數(shù)報告，大于100時，采用兩位有效數(shù)字，在兩位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計算?！边@樣的規(guī)定，不滿足實際工作的要求。當平均菌落數(shù)在10以下，帶有小數(shù)點后面的數(shù)字時，肯定不能按照實有數(shù)報告。因此建議修改為“平均菌落數(shù)按照四舍五入方法，修約為整數(shù)報告。如修約后的數(shù)值超過兩位有效數(shù)字時，后面的數(shù)值用10的指數(shù)來表示?！痹诒鞡.1的例8報告方式中，要求報告為“＜1×10 CFU/mL”，這也是完全不符合常理的，也影響國家標準的嚴肅性。