文 / 方 冰 郭慧媛 張 昊 任發(fā)政 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

1995年，Hakansson等人在研究母乳抗菌活性時(shí)意外發(fā)現(xiàn)，母乳中含有一種特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的物質(zhì)，并且其分子量同乳白蛋白很相近，但單純的乳白蛋白并不能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡，故稱(chēng)這種誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的物質(zhì)為乳白蛋白聚合物[1]。隨后的幾年，Svensson及Svanborg等人對(duì)這種聚合物的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了深入的研究，確定這種聚合物為乳白蛋白－油酸復(fù)合物（Human Alpha-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells，HAMLET），并于2000年成功地在體外合成了這種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的物質(zhì)[2]。近年來(lái)，針對(duì)HAMLET的研究已成為食品、醫(yī)學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。本文將從HAMLET的結(jié)構(gòu)、活性、作用途徑及臨床應(yīng)用4 個(gè)方面展開(kāi)論述。

1 HAMLET的結(jié)構(gòu)

?。榘椎鞍字饕嬖谟诓溉閯?dòng)物的乳汁中，由122或123 個(gè)氨基酸組成，包含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，即較大的α－折疊結(jié)構(gòu)域和較小的β－折疊結(jié)構(gòu)域。這2 個(gè)結(jié)構(gòu)域由Ca2+和4 條二硫鍵穩(wěn)定連接[3]。

乳白蛋白（Lactalbumin，LA）本身并沒(méi)有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性，必須同油酸結(jié)合后才能具備凋亡活性。通過(guò)核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、透射電鏡及原子力顯微鏡觀察HAMLET結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，油酸不是單純的與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈結(jié)合，而是被蛋白質(zhì)包裹而形成膠囊狀復(fù)合物[4]。LA的折疊核心位點(diǎn)在包含Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的α－區(qū)域和β-區(qū)域的界面上[5]。由此可推測(cè)，油酸的結(jié)合區(qū)域很可能是在Ca2+結(jié)合區(qū)域。油酸的結(jié)合使得LA的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變并在一定程度上穩(wěn)定了HAMLET的構(gòu)象。圓二色譜測(cè)定LA及HAMLET的二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)也發(fā)現(xiàn)，HAMLET中的α－螺旋結(jié)構(gòu)要明顯多于LA中的[5]。氨基酸末端序列測(cè)定及氫/氘離子交換NMR研究表明，油酸是通過(guò)與脫去Ca2+后伸展開(kāi)的β-折疊區(qū)域結(jié)合，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為α－螺旋[6]。

2003年，Svensson等人研究了不同碳鏈長(zhǎng)度、不同飽和度、不同雙鍵構(gòu)型的16 種脂肪酸同LA結(jié)合形成HAMLET的能力[7]。結(jié)果表明，LA只能同油酸及其他十八碳飽和脂肪酸（如硬脂酸）、不飽和脂肪酸（如亞油酸）形成具有凋亡活性的復(fù)合物，其他較短碳鏈的飽和及不飽和脂肪酸、反式脂肪酸（包括十八碳）均不能同LA結(jié)合，表明脂肪酸同部分伸展的LA形成了特定的構(gòu)型，從而使得這些復(fù)合物能夠特異性殺死腫瘤細(xì)胞。

2 HAMLET的促腫瘤細(xì)胞凋亡活性

2.1 體外活性

在Hakansson等人首次發(fā)現(xiàn)乳白蛋白復(fù)合物能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的凋亡之后，人們又研究了HAMLET對(duì)其他細(xì)胞的凋亡活性。迄今為止，已測(cè)定了來(lái)源于肺、喉、腎、結(jié)腸、膀胱、前列腺、卵巢、皮膚、淋巴等40 余種腫瘤細(xì)胞對(duì)HAMLET的敏感性[1，8]。所有檢測(cè)結(jié)果皆表明，腫瘤細(xì)胞在HAMLET處理后發(fā)生了凋亡，尤其是淋巴類(lèi)腫瘤細(xì)胞，對(duì)HAMLET的敏感性要高于其他實(shí)體瘤細(xì)胞。

2.2 體內(nèi)活性

HAMLET在體外取得了良好的效果后，研究者開(kāi)始關(guān)注HAMLET在體內(nèi)的抗腫瘤活性。2004年，F(xiàn)ischer等人將人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞懸液注射到裸鼠大腦中，對(duì)造模成功的老鼠顱腔灌注HAMLET，并以LA作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，注射LA的老鼠在8 周后出現(xiàn)顱腔壓力升高等癥狀，而注射HAMLET的老鼠卻無(wú)相應(yīng)癥狀。NMR掃描腦部組織發(fā)現(xiàn)，對(duì)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型鼠的腦腔灌注HAMLET可以顯著減小腦瘤體積，并延長(zhǎng)老鼠的生存時(shí)間，而LA卻無(wú)此作用。同時(shí)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HAMLET可以誘導(dǎo)腦腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)周?chē)】的X細(xì)胞則無(wú)影響[9]。2009年，Mossberg等人對(duì)小鼠膀胱注射人膀胱癌細(xì)胞，造模成功后對(duì)膀胱組織灌注HAMLET和LA進(jìn)行治療。結(jié)果表明，灌注HAMLET組小鼠膀胱腫瘤體積明顯縮小，凋亡檢測(cè)也呈陽(yáng)性結(jié)果。同時(shí)，該研究中將HAMLET和LA進(jìn)行熒光標(biāo)記，通過(guò)全身熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HAMLET僅分布于膀胱癌組織中，在腫瘤組織周?chē)恼＝M織中并無(wú)分布[10]。

3 HAMLET的作用途徑

3.1 穿透細(xì)胞膜

HAMLET處理腫瘤細(xì)胞后會(huì)結(jié)合到細(xì)胞的表面并迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而LA及油酸本身均不具有進(jìn)入細(xì)胞的能力。有學(xué)者利用熒光標(biāo)記的HAMLET和LA處理小鼠淋巴癌細(xì)胞L1210，發(fā)現(xiàn)HAMLET和LA都可以吸附在細(xì)胞表面，但HAMLET卻能夠大量地進(jìn)入L1210的細(xì)胞內(nèi)[1]。熒光及NMR分析結(jié)果表明，乳白蛋白的α－螺旋保護(hù)了HAMLET中的抗腫瘤功能區(qū)[11]。腫瘤細(xì)胞豐富的細(xì)胞膜磷脂或存在于細(xì)胞膜外層的O型糖基化粘液素可能是HAMLET能高效結(jié)合腫瘤細(xì)胞膜并侵入腫瘤細(xì)胞的重要原因。

3.2 改變線粒體的形態(tài)功能

3.3 激活胞內(nèi)蛋白酶

HAMLET除作用于腫瘤細(xì)胞的線粒體和細(xì)胞核外，還作用于細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶和泛素化蛋白酶體系統(tǒng)。侵入腫瘤細(xì)胞中的HAMLET可以同20S蛋白酶體結(jié)合，改變蛋白酶體的結(jié)構(gòu)，從而激活細(xì)胞內(nèi)蛋白酶而降解大量的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，即使隨后去除進(jìn)入細(xì)胞的HAMLET，蛋白酶仍能降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)[13]。同時(shí)，用蛋白酶體類(lèi)的酶，如胃蛋白酶、糜蛋白酶體以及細(xì)胞內(nèi)提取的20S蛋白酶體作用于HAMLET和LA時(shí)發(fā)現(xiàn)，HAMLET耐蛋白酶酶解的能力遠(yuǎn)高于LA。由此可知，HAMLET這種穩(wěn)定的構(gòu)象同其活性密切相關(guān)。

3.4 結(jié)合細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)

以半數(shù)致死量的HAMLET培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞1 h，90%的HAMLET定位于細(xì)胞核內(nèi)。入核的HAMLET以高親和力結(jié)合組蛋白H3，以較低親和力結(jié)合組蛋白H4和H2，破壞組蛋白在DNA上的沉積，最終以高親和力結(jié)合染色質(zhì)，使腫瘤細(xì)胞染色質(zhì)形成非水溶性復(fù)合物，從而致基因轉(zhuǎn)錄停止，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[14，15]。故常在HAMLET處理死亡的腫瘤細(xì)胞內(nèi)可以檢測(cè)到DNA片段及與DNA損傷相關(guān)的Caspase－2[16]。

4 臨床應(yīng)用

HAMELT在臨床治療上的應(yīng)用目前已在皮膚乳頭狀瘤及膀胱癌2 個(gè)方面得到驗(yàn)證。2003年，Gustafsson等人對(duì)40例皮膚乳頭狀瘤患者進(jìn)行了HAMLET的治療研究[17]，以安慰劑作為對(duì)照，給藥3 周，1 個(gè)月后觀察治療結(jié)果。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HAMLET治療組的患者1 個(gè)月后皮膚乳頭狀瘤體積平均縮小75%，而安慰劑組患者僅縮小15%～20%。于是，對(duì)之前給安慰劑的患者同樣采用HAMLET治療，1 個(gè)月后皮膚乳頭狀瘤體積縮小82%。同時(shí)，對(duì)所有接受過(guò)HAMLET治療的患者進(jìn)行為期2年的觀察發(fā)現(xiàn)，這些患者的腫瘤并未復(fù)發(fā)，且未出現(xiàn)其他副作用。在后來(lái)膀胱癌的HAMLET治療研究中[18]，對(duì)9 例患表淺性膀胱癌的患者每天進(jìn)行5 次患處HAMLET滴注，給藥10 天后對(duì)患者的膀胱組織進(jìn)行內(nèi)鏡檢查，發(fā)現(xiàn)有8 名患者的膀胱癌組織體積減小，膀胱癌細(xì)胞脫落。對(duì)病人體內(nèi)殘留的癌組織進(jìn)行凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，這些組織的細(xì)胞都呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征，同時(shí)，也在尿液中檢測(cè)出凋亡的膀胱癌細(xì)胞，而癌旁組織中的正常細(xì)胞未呈現(xiàn)任何凋亡特征。

5 結(jié)語(yǔ)

HAMLET是乳白蛋白同油酸結(jié)合的復(fù)合物，能特異性地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，同時(shí)作用于線粒體、蛋白酶體和細(xì)胞核，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。目前對(duì)HAMLET的形成、結(jié)構(gòu)及活性機(jī)理已有較全面的了解，HAMLET類(lèi)似物的制備方法及活性也正在研究中，這將為臨床治療腫瘤提供新的途徑?！?/p>

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