劉樹雷 何 威 王儒鵬 (新橋醫(yī)院皮膚科,重慶400037)

免疫毒素(Immunotoxins,Its)作為腫瘤靶向治療的策略之一,是將具有導(dǎo)向能力的載體與具有細(xì)胞毒性的分子組合而成的具有特異性殺傷能力的雜合分子,被稱為“生物導(dǎo)彈”[1]。因此,在構(gòu)建免疫毒素時,既要尋找具有細(xì)胞選擇性的定向“載體”,又要篩選高效的毒素“彈頭”。目前研究認(rèn)為,免疫毒素殺傷腫瘤細(xì)胞主要通過以下兩種方式[2]:一是通過與細(xì)胞表面受體結(jié)合,進(jìn)入胞內(nèi)抑制蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮作用;二是毒素蛋白直接作用于細(xì)胞膜,使得細(xì)胞內(nèi)容物泄漏,終致細(xì)胞死亡。本文主要從作用靶點(diǎn)的選擇,彈頭與載體的設(shè)計以及兩者的連接方法等幾個方面綜述免疫毒素構(gòu)建的研究進(jìn)展。

1 免疫毒素作用靶點(diǎn)的選擇

免疫毒素研究最大的障礙是缺少特異性分子標(biāo)志。目前,已知的腫瘤分子標(biāo)志物還沒有僅表達(dá)于腫瘤細(xì)胞而不表達(dá)于正常細(xì)胞。因此,尋找合適的作用靶點(diǎn)是免疫毒素構(gòu)建的關(guān)鍵。目前,對免疫毒素作用靶點(diǎn)研究最多的主要有以下四類受體。

1.1 神經(jīng)肽受體 目前發(fā)現(xiàn),神經(jīng)肽受體主要過度表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面[3]。選擇神經(jīng)肽受體作為免疫毒素治療靶點(diǎn)有以下優(yōu)點(diǎn)[4]:該受體在多種腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)增強(qiáng),而在其他正常組織表達(dá)百分比較少;另外,與此類受體結(jié)合的配體目前已發(fā)現(xiàn)的較多。所有神經(jīng)肽受體可以作為腫瘤治療靶點(diǎn)的主要有四類[4]:①蛙皮素受體-2,主要表達(dá)于肺癌、乳腺癌、結(jié)腸和直腸癌;②血管活性腸肽(VIP)受體-1,主要表達(dá)于肺癌和乳腺癌;③神經(jīng)加壓素受體,主要表達(dá)于胰腺癌;④胃泌素受體(Gastrin receptor),主要表達(dá)于胰腺癌。所有神經(jīng)肽受體都是G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR),其信號傳導(dǎo)通路已被研究清楚,從而有利于制備出針對此類靶點(diǎn)的導(dǎo)向治療藥物。

1.2 表皮生長因子受體 表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于糖蛋白,相對分子質(zhì)量170 kD,是一條含有1 186個氨基酸殘基的多肽鏈,由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域三部分組成[3]。EGFR在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中起重要作用。對乳腺、卵巢、膀胱、結(jié)腸、食道、宮頸、前列腺、肺及頭頸部腫瘤的研究表明,EGFR表達(dá)與上述臟器腫瘤患者的生存時間縮短有密切關(guān)系。由于表達(dá)于多種腫瘤細(xì)胞表面且易于被免疫毒素識別,EGFR被認(rèn)為可以作為腫瘤導(dǎo)向治療的有效靶點(diǎn),已有許多研究者制備出針對該受體的免疫毒素,有的已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗[3]。

1.3 CD105 CD105是一種以同源二聚體形式存在的細(xì)胞膜糖蛋白,可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)受體復(fù)合物而影響細(xì)胞對 TGF-β的反應(yīng)[5]。CD105是新生血管的標(biāo)志,有血管生成的各種組織以及腫瘤組織邊緣的血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)CD105。與正常組織相比,CD105在乳腺癌、肺癌、前列腺癌和子宮頸癌等多種腫瘤組織內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)均明顯上調(diào)。CD105的表達(dá)還可以作為乳腺癌轉(zhuǎn)移和愈后不良的標(biāo)志。新血管生成是實體腫瘤普遍存在的特征,與腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。免疫毒素通過與CD105接合可特異性殺傷新生血管內(nèi)皮細(xì)胞,切斷腫瘤生長所需要營養(yǎng)物質(zhì)的供給,從而抑制腫瘤生長。在動物模型中已證實,放射性核素標(biāo)記的抗CD105單克隆抗體可以有效地進(jìn)入腫瘤組織,提示CD105可以作為腫瘤導(dǎo)向治療的有效靶點(diǎn)[6]。

1.4 腫瘤特異性抗原 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和演變過程也賦予了腫瘤抗原許多自身特點(diǎn),如可以使腫瘤細(xì)胞表面某種抗原表達(dá)增強(qiáng)等。p230表達(dá)在人黑色素瘤、肝癌和乳腺癌細(xì)胞表面的糖蛋白,以黑素瘤細(xì)胞表達(dá)水平最高。因此,對于黑色素瘤而言,p230具有很強(qiáng)的腫瘤特異性。利用能與抗原p230特意性結(jié)合的單克隆抗體SM5-1對401例黑色素瘤臨床標(biāo)本(250例原位黑素瘤和151例轉(zhuǎn)移性黑素瘤)進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn),p230在98%的黑素瘤組織標(biāo)本中表達(dá),而正常組織中除在汗腺有少量表達(dá)外,其余正常組織均不表達(dá)p230[7]。Lewis-Y抗原主要表達(dá)于乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和肺癌,以Lewis-Y抗體為載體的免疫毒素目前已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗[7]。

2 毒素分子的類型和作用特點(diǎn)

2.1 植物來源的毒素 植物來源的毒素是一種核糖體失活蛋白(Ribosome inactivating protein,RIP),主要分為兩型:①Ⅰ型RIP是具有酶活性的一條肽鏈,分子量通常為25～32 kD,由于它沒有和細(xì)胞結(jié)合的能力,因此,這類毒素對完整的細(xì)胞難以施加其毒性,而對無細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)生物合成表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。該類毒素主要包括絲瓜素蛋白(Luffin)、天花粉蛋白(Trichosanthin)、美洲商陸抗病毒蛋白(Phytolacca antiviral protein,PAP)、皂草蛋白(Saporin)、康乃馨蛋白(Dianthin)和多花白樹素(Gelonin)等[8,9]。Li等[9]從 Luffin中又分離出一種目前分子量最小(5.2 kD)的RIP—Luffin P1,其IC50為0.88 nmol/L。Luffin P1以聚合物的形式存在,這樣可增強(qiáng)其RNA N-糖苷酶活性。由于其分子量小、抗原性弱,易被載體攜帶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi),因此,Luffin P1是目前制備免疫毒素彈頭較理想的RIP。②Ⅱ型RIP為分子量在60～65 kD之間的糖蛋白,通過二硫鍵連接的α與β兩條肽鏈組成,其中α鏈有核糖體失活蛋白酶活性,β鏈有與細(xì)胞膜上半乳糖殘基結(jié)合的能力。此類毒素主要包括蓖麻毒素(Ricin)、相思子毒素(Abrin)等[9]。

雖然兩型RIP的來源和結(jié)構(gòu)不同,但作用機(jī)制都十分相似。Ⅰ型或Ⅱ型RIP的α鏈通常具有N-糖苷酶的活性,它們直接作用于核糖體,滅活其60S大亞基,具有很強(qiáng)的抑制蛋白質(zhì)合成的活性。Ⅰ型和Ⅱ型RIP對無細(xì)胞體系中蛋白質(zhì)生物合成的作用效果相似,Ⅰ型 RIP的 IC50在 0.03～4 nmol/L之間,Ⅱ型RIP的IC50在0.1～80 nmol/L之間,而對于細(xì)胞的毒性卻不同,Ⅰ型RIP的 IC50在 200～9 000 nmol/L之間,而Ⅱ型 RIP的 IC50在0.001～0.5 nmol/L之間,Ⅱ型RIP比Ⅰ型RIP要高出106倍。二者對細(xì)胞毒性不同的原因在于Ⅱ型RIP的β鏈具有凝集素功能,能夠介導(dǎo)其α鏈進(jìn)入細(xì)胞[10]。

2.2 細(xì)菌來源的毒素 經(jīng)典的細(xì)菌毒素主要有白喉毒素(Diphtheria toxin,DT)、甲綠單胞菌外毒素(Pseudomonasexo toxin,PE)、霍亂毒素(Cholera toxin,CT)、大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素(Ecoli heat-labile toxin)、志賀氏毒素(Shiga toxin)、百日咳毒素(Pertussis toxin)等,不同細(xì)菌毒素的結(jié)構(gòu)存在一定的差異。DT和PE都是單一的肽鏈(分子量60～70 kD),其分子中含有于細(xì)胞結(jié)合區(qū)(相當(dāng)于植物毒素的β鏈)和酶活性區(qū)。其中PE分子中還含有幫助其轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞漿的轉(zhuǎn)位區(qū)[11]?；魜y毒素和大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素的分子結(jié)構(gòu)相似,都由1條α鏈(分子量約30 kD)和5條β鏈(β鏈分子量為 11.5 kD)構(gòu)成,通過非共價鍵相互作用而連接成五聚體。志賀氏毒素則由1條α鏈(分子量30 kD)和6或7條相似的β鏈(β鏈分子量5 kD)構(gòu)成。百日咳毒素是已知毒素中結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的分子之一,由1條α鏈(分子量28 kD)和5條β鏈聚合連接,5條β鏈的大小不同,其中2條分子量為11.7 kD,其余 3條分別為 9.3、22和23 kD[12]。

大多數(shù)細(xì)菌毒素的作用位點(diǎn)主要為延長因子2(longation factor-2,EF-2)和腺苷酸環(huán)化酶。細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)的過程中,肽鏈的延長需要多種延長因子,但其中最為關(guān)鍵的是EF-2。白喉毒素和綠膿桿菌外毒素具有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性,可以使EF-2發(fā)生糖基化,從而直接導(dǎo)致其失去功效?；魜y毒素、大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素和百日咳毒素主要作用于cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,它們的α亞基也有ADP-核糖轉(zhuǎn)移酶活性,但其作用底物是細(xì)胞膜上的G蛋白,可引起G蛋白功能失調(diào)。理論上只要有一個毒素分子進(jìn)入細(xì)胞即可導(dǎo)致細(xì)胞死亡,然而,異源性和分子量大是細(xì)菌來源毒素存在的最大問題,免疫原性高會引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,分子量大使之對腫瘤細(xì)胞穿透性較差[13]。

2.3 真菌來源的毒素 真菌來源的毒素為數(shù)不多,主要是從不同霉菌中分離的 a-Sarcin、restrictocin(Res)和mitogillin(Mit)等幾種蛋白毒素,這類毒素僅由一條分子量16～17 kD的多肽鏈組成,屬于單鏈核糖體失活蛋白[14]。它們均有特異的核酸內(nèi)切酶活性,可以催化水解28 S RNA 3′-端的單個磷酸酯鍵,導(dǎo)致核糖體60 S亞基失活,從而抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

2.4 人源性蛋白毒素 人源性的蛋白毒素分子包括核糖核酸酶和補(bǔ)體等。人源性蛋白毒素在免疫毒素的構(gòu)建過程中使用較少。這類毒素分子最主要特點(diǎn)是可以避免在人體內(nèi)產(chǎn)生抗外源毒素的抗體,從而使免疫毒素的副作用減少[15]。以人表皮生長因子(hEGF)為載體及人胰核糖核酸酶為彈頭構(gòu)建的重組免疫毒素hEGF-hpRNase,在體外細(xì)胞毒實驗中已顯示對EGFR過度表達(dá)的上皮癌細(xì)胞有明顯的特異性殺傷作用[15]。

3 免疫毒素載體類型

3.1 細(xì)胞因子載體 細(xì)胞因子與其細(xì)胞表面的受體結(jié)合可有效介導(dǎo)毒素的內(nèi)吞。細(xì)胞因子受體水平受細(xì)胞活化和分化的調(diào)節(jié),不同細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子受體表達(dá)水平不同,細(xì)胞因子能選擇特定的細(xì)胞群,因而可用細(xì)胞因子作為靶向載體。在許多腫瘤細(xì)胞表面存在大量細(xì)胞因子和生長因子受體[16],如人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞和肝癌細(xì)胞表面存在大量IL-6受體;急性髓系白血病細(xì)胞表面存在豐富的高親和力粒細(xì)胞-單核細(xì)胞系集落刺激因子受體;T細(xì)胞和部分B細(xì)胞相關(guān)的腫瘤高度表達(dá)CD25分子。CD25是IL-2受體(IL-2R)的α鏈,它與IL-2Rβ鏈與γ鏈一起構(gòu)成高親和力IL-2受體,在理論上就可通過低濃度的細(xì)胞因子IL-2融合蛋白選擇性作用于活化的淋巴細(xì)胞。重組免疫毒素DAB-IL2和PE40-IL2就是以高親和力的IL-2受體為作用靶點(diǎn),作用于表達(dá)IL-2受體的皮膚T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞,達(dá)到靶向殺傷的作用[16,17]。人腎癌細(xì)胞(RCC)表達(dá)大量高親和力的IL-4受體(IL-4R)。人們設(shè)計了以IL-4為載體的免疫毒素,并對IL-4進(jìn)行改造,使其IL-4的羧基和氨基端都融合一個GGNGG肽段,把PE38-KDEL融合在IL-4的37號位點(diǎn)。它比IL-4-PE38KDEL的細(xì)胞毒性高5～10倍,與RCC細(xì)胞的IL-4R親和力高5～12倍[17]。目前常用的作為載體的細(xì)胞因子主要有 IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-15、TGF-α和表皮生長因子(EGF)等。

3.2 單克隆抗體 單克隆抗體具有和腫瘤細(xì)胞表面特異性抗原結(jié)合的能力,而被廣泛用作免疫毒素的載體。單克隆抗體一般選用IgG分子,因為其它亞類的免疫球蛋白分子容易聚集,不宜純化。完整的IgG分子量大,穿透性差,應(yīng)用過程中受到一定限制,故近年來人們采用基因工程手段,制備出具有滲透性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向特異性的小分子抗體[18],常見的有單鏈抗體(scFv),其分子量較小(約25 kD),它是將單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)片段(VL)與重鏈可變區(qū)片段(VH)由柔性連接肽連接而成。scFv保留了完整抗體的特異性和親合力。許多scFv免疫毒素在抗血液腫瘤和實體瘤上已顯示出良好的效果。為了進(jìn)一步減小抗體分子量,人們又設(shè)計了僅含重鏈可變區(qū)(VH)的單域抗體,其分子量僅為單鏈抗體的一半,但保留了單鏈抗體大部分的抗原結(jié)合能力。不論是單鏈抗體還是單域抗體,所構(gòu)建免疫毒素的半衰期都比較短,在體內(nèi)容易被廓清。近年來,人們又開發(fā)了人源化抗體,目前研究較多的是各種基因工程抗體,其設(shè)計目的是盡量降低抗體在體內(nèi)誘發(fā)的免疫排斥反應(yīng);其主要特點(diǎn)是既保持了抗體的親和力,又不易引發(fā)免疫反應(yīng),而且在人體內(nèi)的半衰期也較長。目前以單克隆抗體為載體的一些免疫毒素已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗[18]。

4 免疫毒素偶聯(lián)方式

免疫毒素的制備除了要選擇合適的靶向部分和毒性部分外,還應(yīng)考慮到如何選擇最恰當(dāng)?shù)姆椒▉磉B接這兩部分。

4.1 化學(xué)偶聯(lián)法 化學(xué)偶聯(lián)法最早用于單抗和藥物分子之間的連接,后來用于免疫毒素的連接,即人們在載體和毒素分子之間引入異型雙功能交聯(lián)劑,可不影響載體和毒素分子的活性。目前應(yīng)用的雙功能交聯(lián)劑有N-羥基琥珀酰亞胺、N-琥珀酰-3-2-聯(lián)硫基吡啶-丙酸鹽(SPDP)、2-IT、MBS 、間苯甲酸酯 、S-乙酰巰基琥珀酸酐等,其中SPDP和MBS較為常用。SPDP是與蛋白質(zhì)的伯氨基反應(yīng),在蛋白質(zhì)上引入2-吡啶二硫化物基團(tuán),在二硫蘇糖醇(DTT)的作用下暴露出SH基,再與另一連接了SPDP的蛋白反應(yīng),通過雙硫鍵將兩個蛋白連接在一起[19]。MBS是與蛋白質(zhì)伯氨基反應(yīng),在蛋白質(zhì)上引入一個穩(wěn)定的化學(xué)基團(tuán),即馬來酰亞胺基團(tuán),然后與另一含巰基鍵蛋白質(zhì)反應(yīng),通過中間的馬來酰亞胺基團(tuán)將兩個蛋白連接在一起[18],MBS連接后的融合蛋白比用SPDP連接的融合蛋白質(zhì)穩(wěn)定。免疫毒素的化學(xué)偶聯(lián)法存在的主要問題是分子量大、免疫原性高、載體和毒素分子在體內(nèi)容易分離。

4.2 基因工程融合法 基因工程融合法制備的重組免疫毒素,是用分子生物學(xué)技術(shù)將載體部分與毒性部分通過Linker進(jìn)行基因串聯(lián)[20]。通過PCR方法擴(kuò)增目的基因片段,并對目的基因片段和載體進(jìn)行雙酶切,然后把目的基因片段連接到載體上,再將其克隆至表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入表達(dá)菌如BL21(DE3)中,以異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)其表達(dá)。并經(jīng)過蛋白的純化、鑒定等方法,最后得到有活性的融合蛋白。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),如果某些外源基因連接上適當(dāng)?shù)亩ㄎ恍盘栃蛄?使外源蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后定向運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的特定部位如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或液泡等,可明顯提高外源蛋白的穩(wěn)定性和累積量。這是因為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等特定區(qū)域為某些外源蛋白提供了一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境,有效地防止了外源蛋白的降解。已有實驗證實,在大腸桿菌中表達(dá)帶有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號肽(KDEL)的ricin A-KDEL比不帶KDEL結(jié)構(gòu)的ricin A的細(xì)胞毒活性明顯提高?；蚬こ倘诤戏ǖ玫降娜诤系鞍子袃煞N表達(dá)形式,一種是可溶性表達(dá),這是蛋白比較理想的一種表達(dá)形式。另一種是包涵體表達(dá)。包涵體表達(dá)需經(jīng)變性及復(fù)性過程,操作復(fù)雜,蛋白損失較大,活性降低,因而成為是基因工程融合蛋白純化過程的重點(diǎn)和難點(diǎn)[20]。

5 存在的問題與展望

目前,構(gòu)建的免疫毒素還存在以下幾方面的問題[21]:①免疫毒素大多是由異源性的抗體為靶向載體,對機(jī)體來說是異種蛋白,容易在體內(nèi)產(chǎn)生免疫反應(yīng),加速了免疫毒素的衰減,同時也增加了副作用;②免疫毒素的毒素部分分子量較大,對組織的穿透性差,對實體瘤的穿透力弱,容易被機(jī)體清除;③多數(shù)免疫毒素存在非特異毒性,與正常細(xì)胞及組織可非特異性結(jié)合,從而引起許多副作用,如血管滲漏綜合征等。

針對免疫毒素存在的上述問題,可以通過以下途徑使之改善[21]:①尋找靶細(xì)胞上特異性靶點(diǎn),以及通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面靶點(diǎn)的表達(dá)促進(jìn)免疫毒素的作用;②降低免疫毒素的抗原性,包括對決定載體及毒素分子免疫原性的部位進(jìn)行定位突變或基因刪除等修飾,選擇小分子量的毒素,開發(fā)人源化的載體及毒素等;③選擇恰當(dāng)?shù)倪B接子以提高載體和毒素分子的穩(wěn)定性。

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