程朝彬，陳建華

維生素 C（vitamin C，VC）即 L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，L-AA），是一種水溶性維生素，最早從腎上腺中分離得到[1]。人體中缺乏 L-古龍酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶（L-gulono-1,4-lactone oxidase），無法自身合成 VC，必須依靠膳食攝取[2]。VC 生理功能廣泛，普遍用于臨床治療中[3]。此外，VC 在食品飲料、化妝品和飼料等工業(yè)中有著廣泛用途[4]。VC 應用范圍的增加迅速加劇了市場需求，全球每年 VC的需求量約為 8 萬噸，其中 55% 用于醫(yī)藥工業(yè)；35% 用于食品和飲料工業(yè)；10% 用于養(yǎng)殖工業(yè)[1]。

20 世紀 30 年代以前，VC 主要從檸檬中分離提取，價格高昂，遠不能滿足人們的需要。1933 年首次實現(xiàn)用L-木酮糖（L-xylosone）化學合成 VC，在此基礎上 Bremus等[5]引入一步生物發(fā)酵將 D-山梨醇（D-sorbitol）轉(zhuǎn)化為L-山梨糖（L-sorbose），實現(xiàn)從 D-葡萄糖化學合成 VC，并用于工業(yè)化生產(chǎn)。“萊氏法”經(jīng)過大量的優(yōu)化改進，然而由于其高能耗，一些化學反應需要高溫、高壓條件，易造成環(huán)境污染等[6]，各國學者一直致力于尋找更經(jīng)濟、有效的替代工藝。于是，微生物轉(zhuǎn)化法的生物技術工藝逐漸被重視。這里，我們主要概述近年來用微生物生產(chǎn) VC 的研究進展。

1 細菌合成 VC

在過去的 30 年中，利用細菌生物轉(zhuǎn)化替代現(xiàn)有的萊氏化學合成法生產(chǎn) VC 的研究取得豐碩成果。已發(fā)現(xiàn)的可用于生產(chǎn) VC 的細菌，多數(shù)不能直接合成 VC，一般是先合成一種關鍵中間體 2-酮基-L-古龍酸（2-keto-L-gulonic acid，2-KLGA），再經(jīng)甲醇酯化得到 VC。這些細菌以 D-葡萄糖（D-gulose）、D-山梨醇或 L-山梨糖為底物，根據(jù)生產(chǎn)2-KLGA 的生物途徑和菌株不同可分為：單菌株發(fā)酵、混菌株發(fā)酵和基因工程菌株發(fā)酵。

1.1 單菌株發(fā)酵

Sugisawa 等[7]報道一株突變菌株，葡萄糖酸桿菌IFO3293（Gluconobacter melanogenus IFO3293）能以 D-山梨醇或 L-山梨糖為底物發(fā)酵生產(chǎn) 2-KLGA，最終產(chǎn)量分別為 50% 和 60%，但發(fā)酵過程中產(chǎn)生副產(chǎn)物 L-艾杜糖酸（L-idonic acid）等，發(fā)酵液中分離純化 2-KLGA 困難，阻礙其用于工業(yè)生產(chǎn)。早前研究認為只有葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）能以 D-山梨醇和 L-山梨糖為底物合成 2-KLGA，但 Urbance 等[8]從生酮基古龍酸菌屬（Ketogulonicigenium）中分離出 2 株菌可以將 20 g/L 的L-山梨糖轉(zhuǎn)化為 9.3 g/L的 2-KLGA，最近研究報道用普通生酮基古龍酸菌 DSM 4025（Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025）在 110 h 連續(xù)發(fā)酵過程中，可以將 114 g/L L-山梨糖轉(zhuǎn)化為 112.2 g/L 的 2-KLGA，其平均底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率可達 91.3%[9]。

另有研究報道，K. vulgare DSM 4025 活細胞或靜息細胞均可利用 D-山梨醇、L-山梨糖、L-葡萄糖（L-gulose）和L-山梨醛（L-sorbosone）直接合成 VC，該菌目前報道最高的產(chǎn)量是以 5 g/L L-山梨醛為底物發(fā)酵制得 1.37 g/L的VC[10]。此外，Rao 和 Sureshkumar[11]利用放射性誘變野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）得到的新菌株可利用 D-葡萄糖直接合成 VC。與用化學方法從 2-KLGA 內(nèi)酯化合成 VC 相似，X. campestris 通過內(nèi)酯化 2-KLGA 合成 VC。在合適的培養(yǎng)基中該菌可以將 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為20.4 g/L的 VC，是酵母用 D-葡萄糖直接合成 VC 產(chǎn)量的14 倍。

1.2 混合菌株發(fā)酵

20 世紀 70 年代初，我國科學家建立了一種工業(yè)生產(chǎn)VC 的混菌發(fā)酵工藝，因其由兩個發(fā)酵步驟組成，故又稱為“二步發(fā)酵法”。該方法是目前唯一成功應用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)維生素 C的微生物轉(zhuǎn)化法，國內(nèi)的 VC 生產(chǎn)廠家均采用該法，并轉(zhuǎn)讓給許多西方生產(chǎn)廠商（如 Roche 公司等）[3, 12-13]。

二步發(fā)酵法是在萊氏一步發(fā)酵將 D-山梨醇轉(zhuǎn)化為 L-山梨糖之后，再利用混合菌培養(yǎng)發(fā)酵將 L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC 的前體 2-KLGA[5]，其第二步發(fā)酵是由產(chǎn)酸菌——氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）和其伴生菌混合發(fā)酵完成。該混合菌發(fā)酵體系中，氧化葡萄糖酸桿菌單獨培養(yǎng)困難且產(chǎn)酸能力很低；伴生菌單獨培養(yǎng)容易，不產(chǎn)酸，但可以促進氧化葡萄糖酸桿菌的生長和產(chǎn)酸。能與氧化葡萄糖酸桿菌混合培養(yǎng)并促進其生產(chǎn) 2-KLGA 的伴生菌有很多，除常用的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）外，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacilus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等均有該作用[12,14]。對于伴生菌和產(chǎn)酸菌之間的生理和代謝關系目前研究認為：氧化葡萄糖酸桿菌中含有 2-KLGA 合成所必需的關鍵酶，而伴生菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生幾種蛋白質(zhì)或者小分子物質(zhì)[15]，這些組分的作用從而促進小菌產(chǎn)生 2-KLGA。但大小菌之間具體的伴生機制仍需進一步研究。

二步發(fā)酵法中 2-KLGA 的合成路線，Bremus 等[5]給予詳細的闡述：第一步發(fā)酵，D-葡萄糖經(jīng)中間體 D-葡萄糖酸（D-gluconate）和 2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D- gluconate）最終氧化成 2,5-二酮基-葡萄糖酸（2,5-diketo-D- gluconate），此過程是由歐文菌（Erwinia）或醋酸桿菌（Acetobacter）發(fā)酵完成。第二步發(fā)酵，一株棒狀桿菌（Corynebacterium）完成 2,5-二酮基-葡萄糖酸到 2-KLGA 的轉(zhuǎn)變，該反應是由還原型輔酶 II（NADPH）依賴 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶（2,5-diketo-D-gluconate reductase）催化完成的。因此，聯(lián)合幾種微生物如條紋假單胞菌（Pseudomonas striata）、氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydan）和棒狀桿菌可以實現(xiàn)以 D-葡萄糖酸為底物直接合成 2-KLGA。

1.3 基因工程菌株

最早在草生歐文菌（Erwinia herbicola）中實現(xiàn)遺傳重組，構(gòu)建的工程菌能以葡萄糖為底物生產(chǎn) 2-KLGA。將Corynebacterium sp. 中 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶轉(zhuǎn)化至草生歐文菌，得到的工程菌能以 D-葡萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn) 2-KLGA。在葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase）、葡萄糖酸脫氫酶（gluconate dehydrogenase）、酮葡萄糖酸脫氫酶（ketogluconate dehydrogenase）和 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶的作用下，構(gòu)建的工程菌發(fā)酵 120 h 內(nèi) 2-KLGA的產(chǎn)量達到 120 g/L[16]。

在野生葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）中僅有少數(shù)菌株可以在 D-山梨醇脫氫酶（D-sorbitol dehydrogenase）、L-山梨糖脫氫酶（L-sorbose dehydrogenase）和 L-山梨醛脫氫酶（L-sorbosone dehydrogenase）作用下以 D-山梨醇為底物合成 2-KLGA，其最終產(chǎn)率很低[17-18]。而通過基因工程改造葡萄糖桿菌屬菌株，可實現(xiàn)大量生產(chǎn) 2-KLGA[19]。Saito等[20]將 G. oxydans T-100 中編碼 L-山梨糖脫氫酶和 L-山梨醛脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入 L-山梨糖（L-sorbose）生產(chǎn)菌株 G.oxydans G624 中，得到重組菌株可以高產(chǎn) 2-KLGA，產(chǎn)量達到130 g/L，是野生菌株產(chǎn)量的 230%。

另有研究報道，將液化醋化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）編碼 L-山梨醛脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入 G. oxydans IFO 3293 中，新構(gòu)建的工程菌展示出很高的 L-山梨糖或L-山梨醛轉(zhuǎn)化 2-KLGA 的活性[21]。該工程菌株靜態(tài)細胞發(fā)酵系統(tǒng)利用 L-山梨糖生產(chǎn) 2-KLGA 的產(chǎn)量可達 40 g/L。

Shibata 等[22]將 G. oxydans 中編碼 D-山梨醇脫氫酶、L-山梨糖脫氫酶和 L-山梨醛脫氫酶的基因重組入一株惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基后，重組菌株可以將 50 g/L 的底物 D-山梨醇轉(zhuǎn)化為 16 g/L 的產(chǎn)物2-KLGA。但其中 15 g/L 的 D-山梨醇仍留在發(fā)酵液中未被利用，因此為使該重組菌用于工業(yè)生產(chǎn)，需提高 D-山梨醇脫氫酶基因的表達水平或選育能適應高濃度山梨醇的菌株。

基因工程菌研究成果很多，重組的菌株或多或少的可以生產(chǎn) 2-KLGA，但沒有一株菌是可以直接將 D-葡萄糖、D-山梨醇或者它們的氧化物轉(zhuǎn)化為 VC。因此，可以轉(zhuǎn)化2-KLGA為 VC 的酶引起了學者的興趣。最近，Berry 等[23]報道 D-山梨醛脫氫酶能將 L-山梨醛轉(zhuǎn)化為 VC，相關的基因克隆自 G. oxydans N44-1 并可在同株菌種高表達。新菌株的靜息細胞實驗，可以將 10 g/L的 L-山梨醛轉(zhuǎn)化為4.2 g/L的 VC。

如上所述，目前實現(xiàn)工業(yè)利用 D-葡萄糖或 D-山梨醇生物合成 VC 仍然有很長的一段路。因此，今后研究重點主要在提高基因表達、優(yōu)化發(fā)酵條件、限制副產(chǎn)物生成等。

2 酵母合成 VC

雖然在酵母浸出液中發(fā)現(xiàn)了 VC，但自然條件下的酵母并不能合成 VC。相反，酵母可以合成一種 VC 類似物D-紅抗壞血酸（D-erythroascorbic acid，D-EAA）[1]。盡管該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與 VC 不同，但其具有相似的氧化-還原性質(zhì)，在酵母中起著與 VC 相似的抗氧化作用[24]。因此，D-EAA 可代替 VC 運用于工業(yè)生產(chǎn)中，但 D-EAA 沒有抗壞血病作用，因此其商業(yè)價值不及 VC[5]。

研究發(fā)現(xiàn)酵母中合成 D-EAA 最后的兩步與植物中合成 VC 的步驟極其相似。D-阿拉伯糖（D-arabinose）被轉(zhuǎn)化為 D-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯（D-arabinono-1,4-lactone），最后被氧化為 D-EAA，該過程中分子結(jié)構(gòu)構(gòu)型改變與植物中L-半乳糖（L-galactose）經(jīng) L-半乳糖-1,4 內(nèi)酯（L-galactono-1,4-lactone）合成 VC 的分子構(gòu)型改變完全相同[1]?？墒?，此過程中相關的酶 L-半乳糖-1,4內(nèi)酯化脫氫酶（L-GL-DH，植物）和 D-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯氧化酶（D-AL-Ox，酵母細胞）的催化性質(zhì)完全不同。體外實驗表明從白色念珠菌（Candida albicans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分離純化的 D-AL-Ox 不僅可以催化利用 L-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯（L-arabinono-1,4-lactone），還可以利用 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯（L-galactono-1,4-lactone ）和 L-古龍酸-1,4-內(nèi)酯（L-gulono-1,4-lactone）。此外，C. albicans還能以 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯為底物發(fā)酵生產(chǎn) VC[25-26]。

酵母中催化合成 D-EAA 最后兩步中的 D-阿拉伯糖脫氫酶（D-arabinose dehydrogenase, D-Ara-DH），同樣有著廣泛的底物適用范圍。體外實驗證明，從 C. albicans 和S. cerevisiae中分離的該酶不僅可以利用 D-阿拉伯糖合成D-阿拉伯糖膠-1,4內(nèi)酯，還可以利用 L-半乳糖合成 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯。S. cerevisiae 中相關功能基因已被克隆，并且敲除該基因會導致該菌合成 D-EAA 功能的完全缺失[27]。另據(jù)研究顯示 S. cerevisiae 經(jīng) L-半乳糖孵育后細胞內(nèi)有VC 生成，這有可能是因為內(nèi)源性的 D-AL-Ox 和 D-Ara-DH 活性所致[25]。

D-EAA 生物合成的多種途徑為開拓酵母一步發(fā)酵生產(chǎn)VC 提供新的研究方向。目前已經(jīng)有報道經(jīng)基因工程改造的S. cerevisiae 和拜耳結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）可以生產(chǎn) VC。過表達 S. cerevisiae 中 D-Ara-DH 和 D-ALOx 可顯著增加其以 L-半乳糖為底物生產(chǎn) VC 的能力。在出芽酵母細胞轉(zhuǎn)入內(nèi)源性的 D-AL-Ox 和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中 L-半乳糖脫氫酶（L-galactose dehydrogenase），構(gòu)建的工程菌可以轉(zhuǎn)化 40% 的底物 L-半乳糖，得到100 mg/L 的 VC[28]。

然而，酵母不能合成 L-半乳糖或其衍生物，需要外部供給。這些物質(zhì)的成本較高，使得該生產(chǎn)方法不經(jīng)濟，解決方案：①篩選可以利用廉價的底物合成 L-半乳糖的細菌菌株，并與酵母混合發(fā)酵；②構(gòu)建載有合成 D-EAA 全部基因的原核生物工程菌；③利用遺傳工程改造酵母使其載有合成VC 的全套基因，以期適用于工業(yè)生產(chǎn)。

3 微藻類合成 VC

嘗試使用微藻這種廉價的原料直接生產(chǎn) VC 是近年來微生物生產(chǎn) VC 新方向。Running 等[29]報道淀粉核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）可以一步發(fā)酵 VC，該野生型的細胞 VC 產(chǎn)量僅 40 mg/L，經(jīng)化學誘變和對發(fā)酵條件的優(yōu)化，其產(chǎn)量可提高至 2 g/L。但大部分的 VC 存留在微藻的細胞內(nèi)，目前該方法僅被用來制作高營養(yǎng)的動物飼料和食品添加劑[1]。Running 等利用誘變育種技術得到 1 株 Prototheca moriformis ATCC 75669，可以將合成的 VC 分泌到胞外，同時 VC 產(chǎn)量比原始菌也有很大的提高[30]。

此外經(jīng)過不斷改良品系，Running 等[30]從原壁菌屬（Prototheca）選育出眾多能夠合成VC 的突變株，這些突變菌株被用于幫助研究一條涉及含有甘露糖的中間體生物合成 VC的途徑。在植物中，D-葡萄糖經(jīng) GDP-D-甘露糖（GDP-D-mannose）、GDP-L-半乳糖（GDP-L-galactose）、L-半乳糖合成 L-葡糖酸-1,4-內(nèi)酯，最終 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯被 L-GL-DH 轉(zhuǎn)化為 VC。該途徑最早分別由Bremus等[5]在 P. moriformis 和尚增振等[31]在高等植物中發(fā)現(xiàn)。

微藻中 VC 合成途徑的闡明有助于其在基因工程上的改造，從而提高 VC 產(chǎn)量并用于工業(yè)化生產(chǎn)。但由于微藻培養(yǎng)的緩慢生長速度和代謝活性，要實現(xiàn)其工業(yè)生產(chǎn) VC仍有很長一段路要走。

4 展望

目前，用于工業(yè)化生產(chǎn) VC 的方法主要是“萊氏法”和“二步發(fā)酵法”?！叭R氏法”因其種種弊端，已經(jīng)失去了 VC生產(chǎn)的主導地位。而“二步發(fā)酵法”雖然解決了萊氏化學合成過程的“三廢”等問題，但該方法涉及二步三種菌，菌種傳代困難，操作工序繁瑣，不能直接把葡萄糖作為發(fā)酵原料。因此，今后的研究重點是利用基因工程技術，重組構(gòu)建新型工程菌株，實現(xiàn)以葡萄糖為底物直接生產(chǎn) VC 的一步發(fā)酵途徑。

[1] Zhang JF, Chen JH. Research progress on application of eukaryotic microbiology of synthesis of vitamin C. Chin J Biochem Pharma,2009, 30(5):354-356. (in Chinese)張劍鋒, 陳建華. 應用真核微生物合成維生素C的研究進展. 中國生化藥物雜志, 2009, 30(5):354-356.

[2] Kaneko J, Harvey J, Bruss M. Clinical biochemistry of domestic animals. 6th. Salt Lake City: Academic Press, 2008.

[3] Oluwafemi OO. The biochemical, physiological and therapeutic roles of ascorbic acid. Afr J Biotechnol, 2008, 7(25):4700-4705.

[4] Zhang J, Liu LM, Liu J, et al. Progress in biotechnological production of vitamin C. J Food Sci Biotechnol, 2008, 27(5):1-7. (in Chinese)張靜, 劉立明, 劉杰, 等. 生物技術法生產(chǎn)維生素 C的研究進展.食品與生物技術學報, 2008, 27(5):1-7.

[5] Bremus C, Herrmann U, Bringer-Meyer S, et al. The use of microorganisms in L-ascorbic acid production. J Biotechnol, 2006,124(1):196-205.

[6] Yan FL. Progress of vitamin C prodctive technogy. China Prac Med,2008, 3(1):132-134. (in Chinese)燕方龍. VitC生產(chǎn)技術的研究進展. 中國實用醫(yī)藥, 2008,3(1):132-134.

[7] Sugisawa T, Hoshino T, Masuda S, et al. Microbial production of 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose and D-sorbitol by Gluconobacter melanogenus. Agric Biol Chem, 1990, 54(5):1201-1209.

[8] Urbance JW, Bratina BJ, Stoddard SF, et al. Taxonomic characterization of Ketogulonigenium vulgare gen. nov., sp. nov. and Ketogulonigenium robustum sp. nov., which oxidize L-sorbose to 2-keto-L-gulonic acid. Int J Syst Evo Microbiol, 2001, 51(Pt 3):1059-1070.

[9] Takagi Y, Sugisawa T, Hoshin T. Continuous 2-keto-L-gulonic acid fermentation from L-sorbose by Ketogulonigenium vulgare DSM 4025. Appl Microbiol Biotechnol, 2009, 82(6):1049-1056.

[10] Sugisawa T, Miyazaki T, Hoshino T. Microbial production of L-ascorbic acid from D-sorbitol, L-sorbose, L-gulose, and L-sorbosone by Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025. Biosci Biotechnol Biochem, 2005, 69(3):659-662.

[11] Rao YM, Sureshkumar GK. Direct biosynthesis of ascorbic acid from glucose by Xanthomonas campestris through induced free-radicals.Biotechnol Lett, 2000, 22(5):407-411.

[12] Han XD, Zhang WC, Zhang T. Progress in vitamin C fermentation.Lett Biotechnol, 2009, 20(3):433-435, 454. (in Chinese)韓曉東, 張惟材, 張通. 維生素 C發(fā)酵研究進展. 生物技術通訊,2009, 20(3):433-435, 454.

[13] Buchholz K, Seibel J. Industrial carbohydrate biotransformations.Carbohyd Res, 2008, 343(12):1966-1979.

[14] Song WX, Shao QJ. Advances on the two-stage fermentation of vitamin C synthesis. China Feed, 2008(19):9-12. (in Chinese)宋文新, 邵慶均. 維生素C二步發(fā)酵合成法的研究進展. 中國飼料,2008(19):9-12.

[15] Xue J. Analysis of the essential metabolites of the mixed bacteria in the second step of VC fermentation. Tianjin: Tianjin Uninersity, 2010.(in Chinese)薛佳. 維生素C二步發(fā)酵中混菌間關鍵代謝物關系研究. 天津: 天津大學, 2010.

[16] Chotani G, Dodge T, Hsu A, et al. The commercial production of chemicals using pathway engineering. Biochim Biophys Acta, 2000,1543(2):434-455.

[17] Hoshino T, Sugisawa T, Tazoe M, et al. Metabolic pathway for 2-keto-L-gulonic acid formation in Gluconobacter melanogenus IFO 3293. Agric Biol Chem, 1990, 54(5):1211-1218.

[18] Sugisawa T, Hoshino T, Masuda S, et al. Microbial production of 2-keto-L-gulonic acid from L-sorbose and d-sorbitol by Gluconobacter melanogenus. Agric Biol Chem, 1990, 54(5):1201-1209.

[19] Saito Y, Ishii Y, Hayashi H, et al. Cloning of genes coding for L-sorbose and L-sorbosone dehydrogenases from Gluconobacter oxydans and microbial production of 2-keto-L-gulonate, a precursor of L-ascorbic acid, in a recombinant G. oxydans strain. Appl Environ Microbiol, 1997, 63(2):454-460.

[20] Saito Y, Ishii Y, Hayashi H, et al. Direct fermentation of 2-keto-L-gulonic acid in recombinant Gluconobacter oxydans.Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2-3):309-315.

[21] Shinjoh M, Tomiyama N, Asakura A, et al. Cloning and nucleotide sequencing of the membrane-bound L-sorbosone dehydrogenase gene of Acetobacter liquefaciens IFO 12258 and its expression in Gluconobacter oxydans. Appl Environ Microbiol, 1995, 61(2):413-420.

[22] Shibata T, Ichikawa C, Matsuura M, et al. Metabolic engineering study on the direct fermentation of 2-keto-L-gulonic acid, a key intermediate of L-ascorbic acid in Pseudomonas putida IFO3738.J Biosci Bioeng, 2000, 90(2):223-225.

[23] Berry A, Lee C, Mayer AF, et al. Microbial production of L-ascorbic acid: US, 20100203598. 2010-08-12.

[24] Huh WK, Lee BH, Kim ST, et al. D-Erythroascorbic acid is an important antioxidant molecule in Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol, 1998, 30(4):895-903.

[25] Hancock RD, Galpin JR, Viola R. Biosynthesis of L-ascorbic acid(vitamin C) by Sacchararomyces cerevisiae. FEMS Microbiol Lett,2000, 186(2):245-250.

[26] Survase SA, Bajaj IB, Singhal RS. Biotechnological production of vitamins. Food Technol Biotechno, 2006, 44(3):381-396.

[27] Kim ST, Huh WK, Lee BH, et al. D-arabinose dehydrogenase and its gene from Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta, 1998,1429(1):29-39.

[28] Sauer M, Branduardi P, Valli M, et al. Production of L-ascorbic acid by metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae and Zygosaccharomyces bailii. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(10):6086-6091.

[29] Running JA, Huss RJ, Olson PT. Heterotrophic production of ascorbic acid by microalgae. J Appl Phycol, 1994, 6(2):99-104.

[30] Running JA, Severson DK, Schneider KJ. Extracellular production of L-ascorbic acid by Chlorella protothecoides, Prototheca species, and mutants of P. moriformis during aerobic culturing at low pH. J Ind Microbiol Biotechnol, 2002, 29(2):93-98.

[31] Shang ZZ, Ma FW, Li W. Advance in research on Vitamin C biosynthetic pathways and its related enzymes in higher plants.Beijing: Sciencepaper Online. (2007-06-01) [2011-04-22]. http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/200706-26.尚增振, 馬鋒旺, 李威. 高等植物中維生素C合成及其相關酶研究進展. 北京: 中國科技論文在線. (2007-06-01) [2011-04-22]. http://www.paper.edu.cn/index.php/default/releasepaper/content/200706-26.