陳靜靜 沈志森，2* 鞏長鳳 康 騁 竺亞斌*

1(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波 315211)

2(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬李惠利醫(yī)院，寧波 315211)

引言

骨骼肌組織是人體運動系統(tǒng)重要構(gòu)件，它的收縮和放松活動是人體各種運動的基礎(chǔ)。各種外界刺激可引起肌組織的損傷以及肌細(xì)胞的凋亡和壞死，極大地影響人們的運動能力和生活質(zhì)量，而且骨骼肌損傷的發(fā)病率逐年提高。因此，有關(guān)骨骼肌損傷后修復(fù)、再生和重建的細(xì)胞、分子以及力學(xué)水平的機制研究日益受到重視。然而骨骼肌自身修復(fù)的能力有限，其修復(fù)過程是一個由外部力學(xué)因素和內(nèi)部細(xì)胞因素兩者共同協(xié)調(diào)完成的復(fù)雜且呈多階段的過程。組織工程技術(shù)的出現(xiàn)和日益發(fā)展，給我們修復(fù)骨骼肌組織提供了新的方法。而骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞作為肌組織體外構(gòu)建的種子細(xì)胞，也受到了越來越多的研究。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞起源于胚胎中胚層，存在于肌細(xì)胞基底膜與肌膜之間，具有增殖分化的潛能[1]。當(dāng)骨骼肌受損傷時，基底膜的完整性受到破壞，肌肉的血供發(fā)生改變，支配肌肉的神經(jīng)受損，這些因素可使肌衛(wèi)星細(xì)胞由靜息狀態(tài)進入有絲分裂循環(huán)[2]。但是肌衛(wèi)星細(xì)胞在成年哺乳動物骨骼肌中含量較少，大約占1% ～4%[3]，作為種子細(xì)胞，首先需要在體外培養(yǎng)、擴增。當(dāng)體外擴增達到一定數(shù)量時，與生物材料和/或支架復(fù)合培養(yǎng)，最終構(gòu)建組織工程化骨骼肌。隨著組織工程學(xué)的日益發(fā)展和完善，體外構(gòu)建的組織工程化骨骼肌完全有希望修復(fù)或替代病變肌組織，改善骨骼肌的功能，降低肌病死亡率，提高病患的生活質(zhì)量。

除了骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞外，其他類型的干細(xì)胞也逐漸被用于骨骼肌組織工程的研究，如骨髓干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞及源于血管的干細(xì)胞，它們在特殊的條件下可以誘導(dǎo)分化為骨骼肌細(xì)胞。如Bacou等將脂肪干細(xì)胞移植到兔受損傷的骨骼肌后觀察，肌肉重量和肌纖維以及肌肉的收縮力大大增強[4]。在移植部位的細(xì)胞鑒定表達具有骨骼肌的特征標(biāo)志，表明脂肪干細(xì)胞向骨骼肌方向分化。骨髓干細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞的具體機制還不清楚，可能由于肌肉損傷后供者骨髓干細(xì)胞向肌衛(wèi)星細(xì)胞分化，從而促進肌肉再生。Sapsaolesim等研究證實源于血管的干細(xì)胞群有分化為成肌細(xì)胞譜系的能力并且能有效促進動脈匯合處骨骼肌再生[5]。這些方面的深入探索為骨骼肌組織工程學(xué)提供了良好的研究平臺，具有重要的實際意義。文中將就肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外生長、增殖、鑒定，以及在組織工程化骨骼肌構(gòu)建中的應(yīng)用進展作一綜述。

1 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的培養(yǎng)

1.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞的分離與純化

由于骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞特殊的生理位置，使我們很難將其從動物體的肌組織中分離[6]。另一方面在分離肌衛(wèi)星細(xì)胞時，摻雜著其他細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及其它血管相關(guān)細(xì)胞等，這使得要獲得大量高純度的肌衛(wèi)星細(xì)胞極具挑戰(zhàn)性。對于肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)多采用分步酶消化法，所用酶主要有膠原酶、透明質(zhì)酸酶、胰蛋白酶和鏈激酶等。由于成纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)中有較強的增殖活力和增殖速度，加之其形態(tài)不易與肌細(xì)胞區(qū)別，故常采用差速貼壁法以去除混雜的成纖維細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞接種數(shù)小時后，成纖維細(xì)胞先貼壁，此時將懸浮細(xì)胞取出進行第2次接種，這樣可獲得純凈的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞，當(dāng)衛(wèi)星細(xì)胞貼壁時，可在顯微鏡下觀察到大量紡錘形的單核細(xì)胞出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時間的延長，衛(wèi)星細(xì)胞相互融合形成多核的肌管，最終形成具有方向性的成束骨骼肌。值得注意的是當(dāng)培養(yǎng)基中血清的濃度較高時(如10% ～20%FBS)，肌衛(wèi)星細(xì)胞以分裂增殖為主;而當(dāng)血清濃度較低時(如1% ～5%FBS)，則以分化為主[7-8]。另外，培養(yǎng)箱中的氧氣濃度對細(xì)胞生長也有影響，通常低氧條件下有利于細(xì)胞增殖.Koning等將膠原酶消化后的細(xì)胞懸液置于低氧狀態(tài)(2%O2)37℃中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中增殖達到融合時改用分化培養(yǎng)基(DM)，包括 DMEM、2%FBS、1%雙抗、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵因子-硒補充劑和0.4 mg/mL地塞米松等，可促進骨骼肌細(xì)胞的分化[9]。

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞也采用組織塊培養(yǎng)法。因為多步酶消化法可能清除肌細(xì)胞的表面抗原，使得細(xì)胞的完整性受到破壞，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂。而且經(jīng)過多次酶的處理，許多成肌細(xì)胞被消化。Sharifiaghdas等曾嘗試用組織塊培養(yǎng)法來克服這些困難。組織塊培養(yǎng)中，各類細(xì)胞對基質(zhì)的貼附順序不同。早期主要是一些前體細(xì)胞，晚期貼附的細(xì)胞具有一些原始細(xì)胞的特征，如衛(wèi)星細(xì)胞。已經(jīng)證實晚期貼附細(xì)胞具有不典型的增殖模式和特殊的分化能力[10]。為此我們可以通過細(xì)胞貼附的先后順序來純化肌衛(wèi)星細(xì)胞。由于細(xì)胞的生長需要經(jīng)歷增殖期、細(xì)胞周期停滯期和細(xì)胞分化期，Gabillard等用增殖培養(yǎng)基(F10+10%FCS)使細(xì)胞處于增殖期以達到足夠的數(shù)量，再用分化培養(yǎng)基(DMEM+2%FCS)使細(xì)胞處于分化期而形成多核肌管[11-12]。但是骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)時容易受外界環(huán)境的影響而使分化潛能受到抑制，故如何才能使體外培養(yǎng)的環(huán)境模擬體內(nèi)生長的環(huán)境，還需要作進一步研究。

1.2 各種細(xì)胞因子對體外培養(yǎng)肌衛(wèi)星細(xì)胞的影響

目前研究的重點在于各類細(xì)胞因子對骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響。這類因子主要包括：胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)、微管細(xì)胞粘附分子(VCAM-I)、表皮生長因子(EGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)等[13-19]。這些細(xì)胞因子及其主要功能列于表1。如HGF具有促進細(xì)胞有絲分裂的特性，因此與組織再生有關(guān)。在新生肌管和肌衛(wèi)星細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HGF轉(zhuǎn)錄因子，表明HGF由旁分泌/自分泌機制產(chǎn)生。FGF是骨骼肌在受損時釋放的用于激活成肌細(xì)胞，促使受損組織再生，故其釋放的量與損傷程度相一致。體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞時加入FGF不僅能促進細(xì)胞大量增殖，還可以抑制細(xì)胞過早地分化，這對于獲得大量未分化的衛(wèi)星細(xì)胞非常有利。此外還有些激素類的物質(zhì)也有促進肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，如：生長激素、糖皮質(zhì)激素、胰島素等。最新研究發(fā)現(xiàn)半乳凝素(Galectin-1)在肌衛(wèi)星細(xì)胞激活中出現(xiàn)高表達的現(xiàn)象，成為了肌衛(wèi)星細(xì)胞研究中的熱點之一[20]。顯然肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化是一個多細(xì)胞因子的共同調(diào)節(jié)過程。對這些肌肉營養(yǎng)因子的作用機制、信號傳導(dǎo)、表達調(diào)控及影響因素的深入探討為體外培養(yǎng)衛(wèi)星細(xì)胞提供了良好的平臺。

表1 調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的細(xì)胞因子及其主要功能Tab.1 Functions of the factors

1.3 骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞表達特殊的蛋白使之區(qū)別于其他細(xì)胞，最先發(fā)現(xiàn)的人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的抗體是CD56和PAX7[21]。現(xiàn)已證實動物的肌衛(wèi)星細(xì)胞能合成骨骼肌特異性的蛋白如 Desmin、PAX7、CD34、Caveolin-1、降鈣素受體(calcitonin receptor)、β1-整聯(lián)蛋白(β-integrin)、M-鈣粘蛋白(M-cadherin)及α7-整聯(lián)蛋白(α7-integrin)，目前已發(fā)現(xiàn)前五種蛋白可以有相應(yīng)的抗體進行標(biāo)記和檢測[22-25]。對于人的骨骼肌細(xì)胞最近發(fā)現(xiàn)新的特異性標(biāo)記物如ALDH1、Nanog、Sox2 和 Oct3/4，并認(rèn)為 ALDH1 的表達可促進PAX7表達，且Nanog、Sox2和Oct3/4可使細(xì)胞具有不斷更新的能力，對細(xì)胞的增殖和分化起促進作用[26-27]。

2 組織工程化骨骼肌的構(gòu)建

骨骼肌組織工程的發(fā)展為各種骨骼肌疾病如肌營養(yǎng)不良、脊髓性肌萎縮等帶來了治愈希望，也使腫瘤切除后肌組織缺失進行外科重建成為可能[28]。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的技術(shù)也日趨成熟，但是將成活的細(xì)胞直接移植到受損的組織內(nèi)并使其發(fā)揮生物功能目前還面臨很大的困境，如受損部位的肌組織的基底膜已破壞，缺乏豐富的血液循環(huán)和神經(jīng)支配，這都不利于體外培養(yǎng)的肌細(xì)胞在體內(nèi)生長，加上體內(nèi)免疫系統(tǒng)對異物排斥作用，使移植成功率降低。另外，體外成活的細(xì)胞移植體內(nèi)后，由于缺乏細(xì)胞外基質(zhì)的支持而無法沿著特定的方向生長，也無法形成功能性肌組織[29]。這就需要我們借助具有誘導(dǎo)作用的支架材料來構(gòu)建具有良好方向性、血管化、神經(jīng)化的肌組織，使最終成功構(gòu)建組織工程化的骨骼肌組織成為可能。

2.1 骨骼肌細(xì)胞和生物材料的相容性

組織工程用的生物材料必須具有良好的生物相容性、可降解性、無毒性、低免疫原性以及一定的空間結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。以此構(gòu)建的支持細(xì)胞生長的支架除了具有一定的生物相容性，還需具有相應(yīng)的生物學(xué)功能，以確保植入體內(nèi)不被免疫系統(tǒng)所排斥、不出現(xiàn)毒性反應(yīng)、不致畸、不致癌，能逐漸與機體融合，并發(fā)揮其生理作用。提高種子細(xì)胞和生物材料的相容性是近年來骨骼肌構(gòu)建研究中的熱點之一。通過改進生物材料的表面性能及研制適合細(xì)胞生長并具有一定形狀和性能的支架模型來減少免疫排斥反應(yīng)，成了組織工程學(xué)研究者的目標(biāo)之一。為了使細(xì)胞和生物材料能很好地相容，很多學(xué)者對細(xì)胞與生物材料的界面進行了研究，如竺亞斌等曾建立了用二元胺胺解的方法以在惰性高分子材料表面引入活性-NH2，并進一步利用此活性基團創(chuàng)立戊二醛偶聯(lián)、EDAC偶聯(lián)、層-層靜電自組裝、接枝-涂層等方法引入細(xì)胞相容性因子，如：殼聚糖、明膠、膠原、層黏連蛋白、生長因子等生物大分子，以提高細(xì)胞與支架的相容性，從而促進細(xì)胞的生長與功能分化[30-34]。相信這些功能化界面也將對骨骼肌細(xì)胞的生長有促進作用。Bhardwaj等將地塞米松試劑植入聚乳酸羥基乙酸共聚物(PLGA)中，通過短時間內(nèi)地塞米松的連續(xù)釋放以達到免疫抑制的效果，避免額外使用免疫抑制劑對機體產(chǎn)生的副作用。這種連續(xù)釋放抗炎因子的生物支架可使移植到體內(nèi)的細(xì)胞在局部獲得有效的抗免疫反應(yīng)的能力[35-37]。

2.2 三維支架的構(gòu)建

在正常機體內(nèi)，骨骼肌細(xì)胞處于三維空間結(jié)構(gòu)之中，和周圍微環(huán)境之間有著復(fù)雜的物質(zhì)、能量與信息的傳輸和交換。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)為骨骼肌損傷后的修復(fù)提供了結(jié)構(gòu)和功能的支持。而在體外培養(yǎng)體系中，生物支架則扮演著ECM的角色，支架提供給細(xì)胞穩(wěn)定的三維生長空間，通過合適的孔結(jié)構(gòu)和孔隙率，供細(xì)胞在其中進行物質(zhì)交換、生長代謝，誘導(dǎo)組織形成。隨著細(xì)胞的生長及逐步分泌新的細(xì)胞外基質(zhì)，支架材料逐步降解，最終形成具有一定形狀和生物功能的肌組織。因此，體外構(gòu)建骨骼肌的關(guān)鍵就是構(gòu)建一個適合細(xì)胞生存的三維微環(huán)境，使細(xì)胞在適合其生長和發(fā)育的環(huán)境中不斷增殖，相互間建立連接，并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，為最終形成功能性肌組織奠定基礎(chǔ)。王齊等利用鑄型后的Sylgard 184(硅酮橡膠彈性材料)凹槽與鼠成肌細(xì)胞(C2C12)復(fù)合培養(yǎng)，成功獲取三維極性骨骼肌組織[38]。另外，Zhao Y等通過光刻、電旋轉(zhuǎn)等技術(shù)對聚硅酮橡膠彈性生物材料進行鑄型，然后將細(xì)胞和纖粘連蛋白凝膠、Matrigel等混合并接種在凹槽里，通過凹槽對分化肌管的體積進行限定和極性誘導(dǎo)，進而構(gòu)建出骨骼肌組織模型[39]。Bian等用聚二甲基硅氧烷(PDMS)鑄成三維多孔的模型，這種多孔形狀的模型有利于營養(yǎng)成分和氧氣的運輸，大大提高了細(xì)胞的成活率[40]。隨著三維技術(shù)的不斷發(fā)展，制造立體的具有不同尺寸和形狀的生物支架正在大規(guī)模的開展，但是這些支架在有效支持肌細(xì)胞的生長與分化方面還有待進一步提高，原因在于(1)不能形成連續(xù)的完整的肌組織;(2)支架上的肌細(xì)胞會隨著支架的降解而發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能上的改變。這需要在培養(yǎng)的體系中加入凝膠等一些物質(zhì)以誘導(dǎo)細(xì)胞維持其型貌?？紤]到生物支架材料—膠原在干細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)領(lǐng)域中的應(yīng)用，如果把細(xì)胞接種在由膠原制成的三維支架材料中進行培養(yǎng)，將會成為一個更有效的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)方式。從體外培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞到最終形成骨骼肌組織是個復(fù)雜的過程，不僅需要肌衛(wèi)星細(xì)胞保持成肌活性，還需要支架材料的三維構(gòu)建。

模擬體內(nèi)微環(huán)境是新近提出來的誘導(dǎo)干細(xì)胞向特定的細(xì)胞分化的最佳選擇之一。以往關(guān)于體內(nèi)微環(huán)境的模擬多著重在生長因子的誘導(dǎo)分化，忽略了物理微環(huán)境對于干細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。而肌細(xì)胞和其他細(xì)胞有很大的不同，其梭形的細(xì)胞結(jié)構(gòu)使肌組織呈現(xiàn)狹長的形態(tài);此外由于肌組織的收縮功能使得其處于持續(xù)的動態(tài)牽拉刺激中，這是肌細(xì)胞在體內(nèi)的兩個至關(guān)重要的物理微環(huán)境。因此，人工促使細(xì)胞沿著特定的方向生長就需要生物支架發(fā)揮其巨大的作用。良好的生物支架有利于維持骨骼肌細(xì)胞的表型和功能。在細(xì)胞水平上，力學(xué)刺激可引起成肌細(xì)胞一系列的變化，如增殖、分化、代謝、修復(fù)和存活等，如骨骼肌再生過程中的外部力學(xué)刺激通過一定的機制最終引起細(xì)胞內(nèi)部成肌調(diào)節(jié)因子(MRFs)的變化，MRFs在成肌細(xì)胞成熟過程起著核心的作用[41]。生物材料借助外力如：機械力、磁力等，誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞定向有序地生長。如Yamamoto等將含有磁珠的脂質(zhì)體導(dǎo)入細(xì)胞中，通過細(xì)胞和磁珠之間的靜電作用使磁珠在細(xì)胞中得以有序排列，然后通過外界磁場的作用使細(xì)胞沿著一定的方向生長。這有利于在二維空間中形成大片肌細(xì)胞且使肌細(xì)胞維持其生物功能[42]。

生物支架植入動物體內(nèi)后，由于支架材料的異物性，使給予細(xì)胞營養(yǎng)的血管很難在支架上形成毛細(xì)血管網(wǎng)，當(dāng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞生長空間達到150μm時，由于缺乏充足的氧氣和養(yǎng)分而不能繼續(xù)增殖或者分化，這就限制了衛(wèi)星細(xì)胞體外培養(yǎng)達到組織工程化所需要的數(shù)量、厚度和功能[43]。所以目前需要解決的問題是如何通過生物材料的優(yōu)化使體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞血管化、神經(jīng)化，使植入假體發(fā)揮收縮等生物功能，這也是骨骼肌組織工程研究的難點之一。近年來，眾多學(xué)者在該領(lǐng)域進行了積極探索，也取得了一定的進展，如以血管化為先決條件的支架材料的優(yōu)化設(shè)計，應(yīng)用生長因子，種植血管內(nèi)皮細(xì)胞，制備帶血管蒂的無細(xì)胞基質(zhì)支架，連接體內(nèi)富含血管網(wǎng)的組織等方式進一步的模擬體內(nèi)環(huán)境[44]。Larkin等將已形成肌管的骨骼肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞一起培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)很快便形成神經(jīng)肌肉接頭，收縮張力也比單純體外培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞強[45]。

骨骼肌細(xì)胞體外培養(yǎng)結(jié)合生物材料的成功也將促進食道組織工程的發(fā)展。本實驗室正致力于探索頸段食管支架的構(gòu)建及其組織相容性，為下咽及頸段食管術(shù)后組織缺損提供可能的修復(fù)材料。從組織學(xué)上，食管肌層上1/3段由骨骼肌組成，因此對骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)并結(jié)合生物支架的研究也將為成功構(gòu)建食管支架提供實驗基礎(chǔ)。如何設(shè)計制備一種既具有良好生物相容性又具有合適三維微結(jié)構(gòu)和宏觀外形的生物支架是組織工程領(lǐng)域中最受關(guān)注的課題之一，也是本課題組長期以來的研究重點。我們曾模擬食道組織的天然結(jié)構(gòu)，運用熱致相分離法(TIPS)、靜電紡絲技術(shù)等制備了具有微觀孔結(jié)構(gòu)的三維支架，并對多孔支架與食道原代細(xì)胞如上皮細(xì)胞、肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等的作用情況進行了系統(tǒng)研究，獲得了重要的實驗結(jié)果，為組織工程化食道支架的構(gòu)建建立了良好的實驗基礎(chǔ)[46-48]。

3 結(jié)論及展望

組織工程的最終目的是規(guī)?；a(chǎn)后應(yīng)用于臨床。雖然在動物實驗中運用骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞治療一些肌疾病，獲得了一定的進展，但在實際的臨床應(yīng)用中效果并不理想。一方面由于獲取供體細(xì)胞十分困難，無法進行大規(guī)模的臨床實驗，另一方面骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞尤其是人骨骼肌細(xì)胞來源有限，體外培養(yǎng)技術(shù)尚不完善，對于如何高效培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞有待于進一步的研究。隨著材料科學(xué)的迅猛發(fā)展，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞結(jié)合可降解高分子材料在組織工程領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景和優(yōu)勢。開發(fā)具有一定生物學(xué)活性、能促進骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化、肌組織再生的各類新型復(fù)合材料、仿生材料、生物活性材料及智能型材料，是組織工程材料的重要研究方向。同時，三維培養(yǎng)有利于衛(wèi)星細(xì)胞的體外極性分化和肌管的形成，有利于成肌分化因子和收縮蛋白的表達，是骨骼肌發(fā)生發(fā)育、應(yīng)力加載和骨骼肌肌病治療的良好體外研究模型.。

肌衛(wèi)星細(xì)胞復(fù)合生物材料支架在創(chuàng)傷修復(fù)及在腫瘤外科尤其在頭頸腫瘤手術(shù)后功能重建方面將發(fā)揮重要的作用，因此，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞組織工程在臨床應(yīng)用上具有光明的前景，在未來的醫(yī)療領(lǐng)域必將扮演極為重要的角色。

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