田繼輝， 夏志強(qiáng)， 劉仲濤， 高海曉， 劉文慶

顱咽管瘤是顱內(nèi)常見的先天性腫瘤(約占顱內(nèi)腫瘤的4%)，在兒童中占幕上腫瘤的第一位［1］。顱咽管瘤雖屬良性腫瘤，但易于復(fù)發(fā)。有報(bào)道，手術(shù)治療顱咽管瘤，病死率高達(dá) 38%［2，3］，復(fù)發(fā)率高達(dá)58%［4］。特別是兒童釉質(zhì)型顱咽管瘤，以囊性為主，與下丘腦粘連緊密，術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯高于以實(shí)質(zhì)性為主的成人鱗狀乳頭型顱咽管瘤。目前關(guān)于顱咽管瘤復(fù)發(fā)的生物學(xué)機(jī)制研究甚少，有報(bào)道部分顱咽管瘤向毗鄰腦組織呈絨毛狀浸潤(rùn)性生長(zhǎng)［5］，而腫瘤侵襲性生長(zhǎng)的特性無(wú)疑與術(shù)后腫瘤細(xì)胞殘留、復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

CD147又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞及周圍間質(zhì)纖維細(xì)胞分泌MMPs，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移［6］?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metal Proteinases，MMPs)是一系列蛋白水解酶，在腫瘤侵襲和復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮著重要作用。特別是MMP-9，又稱為IV型膠原酶或膠原酶B，其主要作用底物為IV型膠原。MMP-9是MMPs家族的重要成員之一，通過降解IV型膠原促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑并破壞基底膜以促進(jìn)新生血管形成［7］。本文旨在探討CD147和MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達(dá)及其與釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲性生長(zhǎng)的和復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 40例釉質(zhì)型顱咽管瘤標(biāo)本2007年12月～2009年12月取自北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科，原發(fā)組24例(原發(fā)組納入標(biāo)準(zhǔn)為:第一次手術(shù)，沒有進(jìn)行放療和化療，腫瘤全切，術(shù)后一年內(nèi)，核磁共振復(fù)查，鞍區(qū)未見腫瘤發(fā)生);復(fù)發(fā)組16例(復(fù)發(fā)組納入標(biāo)準(zhǔn)為:第一次手術(shù)，沒有進(jìn)行放療和化療，腫瘤全切，術(shù)后一年內(nèi)，核磁共振復(fù)查，鞍區(qū)有明確腫瘤發(fā)生)。其中男18例，女22例;患者年齡-分布1～18歲，平均8.5歲。腫瘤標(biāo)本取材后甲醛固定、石蠟包埋后做HE染色組織學(xué)分型及免疫組化染色。所有標(biāo)本均經(jīng)病理科醫(yī)師確診為釉質(zhì)型顱咽管瘤。

1.2 方法、試劑及設(shè)備 免疫組織化學(xué)法步驟:將釉質(zhì)型顱咽管瘤石蠟標(biāo)本制成4μm厚切片，常規(guī)二甲苯脫蠟、酒精水化后，浸入3%H2O2溶液中，室溫下孵育10min，蒸餾水沖洗干凈后，電爐或者水浴鍋加熱0.01mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入切片加熱10～15min;滴加正常山羊血清封閉液室溫封閉20min;分別滴加兔抗人CD147單克隆抗體，兔抗人MMP-9單克隆抗體在37℃恒溫箱中孵育2h。經(jīng)磷酸鹽緩沖液PBS沖洗3次各5min后，滴加生物素標(biāo)記的二抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水透明封片。以相應(yīng)的乳腺癌腫瘤標(biāo)本染色作為陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗染色作為陰性對(duì)照(本試驗(yàn)所用試劑均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。TE2000-U倒置生物顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) CD147蛋白表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上，呈棕黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性，MMP-9以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽(yáng)性。在高倍視野(×400)下，每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野的腫瘤細(xì)胞，計(jì)算200個(gè)腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞百分比，根據(jù)半定量免疫組織化學(xué)方法，對(duì)CD147及MMP-9反應(yīng)細(xì)胞顯色強(qiáng)度及范圍進(jìn)行評(píng)價(jià):(1)陰性(-):無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞染色;(2)弱陽(yáng)性(+):陽(yáng)性細(xì)胞小于25%或顯色淺;(3)中度陽(yáng)性(?):陽(yáng)性細(xì)胞在26% ～50%或染色略深;(4)強(qiáng)陽(yáng)性(?):陽(yáng)性細(xì)胞大于50%或顯色深。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 比較原發(fā)組/復(fù)發(fā)組相應(yīng)數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS軟件(13.0)進(jìn)行Mann-Whitney檢驗(yàn)分析與Sprerman檢驗(yàn)分析，P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化顯色結(jié)果 CD147蛋白表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上，在間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞上也有少量表達(dá)，MMP-9主要以胞漿表達(dá)為主，并伴有胞膜表達(dá)，呈黃褐色顆粒，同時(shí)MMP-9在復(fù)發(fā)腫瘤中的連續(xù)表達(dá)主要集中與柵欄狀細(xì)胞的底部，而原發(fā)組的表達(dá)則不連續(xù)。結(jié)果表明:在復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147的總陽(yáng)性表達(dá)率分別為87.5%和37.5%，復(fù)發(fā)組中CD147的表達(dá)變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.784，P＜0.05)。復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中MMP-9的總陽(yáng)性表達(dá)率分別為93.7%和41.7%，復(fù)發(fā)組中MMP-9的表達(dá)變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-3.367，P ＜0.05)(見表1)。

2.2 相關(guān)分析 Sprerman分析顯示:復(fù)發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.652，P ＜0.01)，原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147與MMP-9表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

表1 CD147與MMP-9與在復(fù)發(fā)/原發(fā)釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達(dá)情況及對(duì)比

3 討論

顱咽管瘤的易復(fù)發(fā)傾向，與腫瘤呈侵襲性生長(zhǎng)密切相關(guān)。Kawamata T等［8］報(bào)道顱咽管瘤雖屬良性腫瘤，但部分腫瘤邊界不清，腫瘤組織呈“指樣”突入毗鄰正常腦組織，從而導(dǎo)致單純顯微手術(shù)難以全切腫瘤，術(shù)后易于復(fù)發(fā)。鑒于此，研究與該腫瘤侵襲性生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)密切相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)記物，期望能提前判斷腫瘤的侵襲性和復(fù)發(fā)傾向，從而為術(shù)前個(gè)體化治療方案的制定及術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的早期預(yù)警提供客觀依據(jù)。

人CD147亦稱細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)，屬免疫球蛋白超家族成員。其主要功能為參與細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)的粘附，同時(shí)具有刺激腫瘤細(xì)胞及周圍間質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶，從而進(jìn)一步降解細(xì)胞外基質(zhì)型膠原，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的局部浸潤(rùn)［9］。有研究報(bào)道在膠質(zhì)瘤、骨巨細(xì)胞瘤、泌尿系腫瘤、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中均有CD147表達(dá)增強(qiáng)的出現(xiàn)［10］。在部分腫瘤中還發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤惡性程度的增高，CD147表達(dá)也隨之增多，且與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移相關(guān)［11，12］。本研究對(duì)CD147在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示:CD147蛋白表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿上，在間質(zhì)中的成纖維細(xì)胞上也有少量表達(dá)。復(fù)發(fā)組和原發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147的總陽(yáng)性表達(dá)率分別為 87.5%和 37.5%，復(fù)發(fā)組中CD147的表達(dá)變化明顯高于原發(fā)組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Z=-2.784，P ＜0.05)。CD147 高表達(dá)的病例，腫瘤與毗鄰下丘腦結(jié)構(gòu)粘連緊密，表明CD147蛋白在釉質(zhì)型顱咽管瘤的表達(dá)上調(diào)，并且其表達(dá)率與釉質(zhì)型顱咽管瘤的侵襲和復(fù)發(fā)有關(guān)，隨著腫瘤的粘附，侵襲和復(fù)發(fā)的比例增高，CD147蛋白的表達(dá)率也逐步增加，提示CD147與釉質(zhì)型顱咽管瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)密切相關(guān)。

MMP-9屬于IV型膠原酶，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)和破壞基底膜中Ⅳ膠原，促進(jìn)了腫瘤突破包膜，向毗鄰結(jié)構(gòu)浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［13］。以往的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)，常常導(dǎo)致腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)和復(fù)發(fā)［14］。本研究對(duì)MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤中的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果顯示:MMP-9表達(dá)的部位主要位于胞漿，同時(shí)伴有胞膜染色，其在復(fù)發(fā)釉質(zhì)型顱咽管瘤中的總陽(yáng)性表達(dá)率93.7%，明顯高于原發(fā)組的41.7%(Z=-3.367，P ＜0.05)。MMP-9 高表達(dá)的病例，腫瘤與毗鄰下丘腦結(jié)構(gòu)粘連緊密，且即便腫瘤鏡下全切，術(shù)后一年內(nèi)復(fù)發(fā)率明顯高于MMP-9低表達(dá)的病例。因此，MMP-9可能成為判斷釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲性和復(fù)發(fā)傾向的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)組腫瘤CD147和MMP-9總陽(yáng)性表達(dá)率明顯升高，該組腫瘤多呈指狀或旋渦狀突入毗鄰腦組織，之間無(wú)明確的包膜分隔，與原發(fā)組腫瘤包膜相對(duì)完整，形態(tài)學(xué)上有較顯著不同。由此，進(jìn)一步提示，CD147和MMP-9的高表達(dá)與釉質(zhì)型顱咽管瘤的侵襲性生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)關(guān)聯(lián)緊密。本研究發(fā)現(xiàn)，在復(fù)發(fā)組釉質(zhì)型顱咽管瘤中CD147蛋白與MMP-9蛋白常同時(shí)表達(dá)，二者相關(guān)系數(shù)(r=0.652，P ＜0.01)表明在復(fù)發(fā)組中CD147與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)，提示CD147確能促進(jìn)MMP-9的產(chǎn)生。原發(fā)組中的表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性，可能是CD147刺激MMP-9的分泌未達(dá)到一定“閾值”范圍區(qū)間。同時(shí)可能反映MMP-9的產(chǎn)生不僅與CD147有關(guān)，尚與其他因素有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，MMP-9的表達(dá)與活性與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)等多種活性遞質(zhì)有關(guān)［15，16］，本文亦贊同這一觀點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明CD147、MMP-9在釉質(zhì)型顱咽管瘤侵襲、復(fù)發(fā)過程中發(fā)揮了重要作用，可能成為評(píng)價(jià)顱咽管瘤術(shù)后復(fù)發(fā)傾向的潛在生物學(xué)指標(biāo)。在臨床診治過程中，可通過檢測(cè)腫瘤組織CD147、MMP-9表達(dá)強(qiáng)度的變化趨勢(shì)，在腫瘤全切的基礎(chǔ)上評(píng)估復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)，為釉質(zhì)型顱咽管瘤的診治及改善預(yù)后提供幫助。

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