李 晟， 劉 偉， 楊昆勝， 方 瑾， 肖建新， 葉榮蘋， 黃智慧

多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種臨床常見的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘為主要病理特點的自身免疫性疾病。目前普遍認為，多發(fā)性硬化是環(huán)境和遺傳共同作用的多基因遺傳性疾病，其確切病因尚未完全查清。其中遺傳因素在多發(fā)性硬化的發(fā)病中起十分重要的作用，本研究以多發(fā)性硬化患者和非多發(fā)性硬化對照組為研究對象，采用病例-對照研究方法，應(yīng)用PCR技術(shù)對60例多發(fā)性硬化患者和120例非多發(fā)性硬化患者的Nogo(Neurite Outgrowth inhibitor)基因、雌激素受體(Estrogen receptor，ER)α基因2個基因3個位點的多態(tài)性進行了檢測和分析。

1 對象與方法

1.1 對象 (1)多發(fā)性硬化組:患者系2007年3月～2010年3月本院及其他合作醫(yī)院的門診或住院患者，共60例，主要來源于浙江省，部分來源于云南省，男15例，女45例，均為漢族，年齡17～53歲，平均 (39.22±6.87)歲。病程1個月 ～25年，平均4.07年。全部病例入選標準按照 McDonald(2001)多發(fā)性硬化診斷標準。(2)正常對照組:來自本院門診健康體檢者，共120例，男38例，女82例，均為漢族，年齡18～55歲，平均(41.87±7.38)歲。性別和年齡與多發(fā)性硬化組匹配。兩組均排除免疫性疾病、其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病、代謝性疾病、嚴重心血管疾病、腎病、糖尿病、肝病、腫瘤等。兩組研究對象均為無血緣關(guān)系的散發(fā)人群，所有患者均充分了解研究方案并簽署知情同意書。兩組的性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，表明兩組資料齊同，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 所有受檢者均晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒提取人類白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 試劑配制及來源 DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)。PCR所需試劑:Taq酶混合PCR試劑(北京天根生化)，D2000分子量標準(北京天根生化)。Nogo基因引物采用Gregorio等文獻中的引物［1］。上游引物為:5’-TCA ACA TGA AAT GCC ACA CAA-3’;下游引物為:5’-CAG TCA GTC TGT GCA ATG AAA-3’(引物由昆明晨綠生物技術(shù)有限公司合成)。雌激素受體α基因引物采用李薇等文獻中的引物。上游引物:5’-CTG CCA CCC TAT CTG TAT CTT TTC CTA TTC TCC-3’;下游引物:5’-TCT TTC TCT GCC ACC CTG GCG TCG ATT ATC TGA-3’。凝膠電泳試劑:30%丙烯酰胺、10×TBE、5 ×TBE、過硫酸銨、TEMED(臺灣生工)，DNA Maker(北京天根生化)，6 ×loading buffer(北京天根生化)。

1.2.3 Nogo基因PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及電泳分析 樣本基因組DNA首先通過PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)總體積為25μl，其中內(nèi)含50ng基因組 DNA，Taq酶 PCR 混合試劑 12.5μl，引物(10pmol/L)上下游引物各 0.5μl，最后補充去離子水至終體積25μl。PCR反應(yīng):采用兩步法，反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min→94℃變性45s→59℃退火及復(fù)性40s，共35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳分析:PCR產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，以5V/cm(1～8V/cm)的電壓進行電泳。溴乙啶室溫染色40min，水洗，UV燈下觀察并照相。按照3種等位基因特異性片段的不同，在電泳圖譜上鑒定Nogo基因3’端未編碼區(qū)CAA插入/缺失突變不同的基因型。Nogo基因基因型:電泳圖呈63bp(等位基因Ins，為CAA插入)或60bp(等位基因Del為CAA缺失)條帶，有3種基因型，即Del/Del型、Ins/Del型、Ins/Ins型。

1.2.4 雌激素受體α基因PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件及電泳分析 PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)總體積為30μl，其中內(nèi)含100ng基因組 DNA，Taq酶 PCR混合試劑15μl，引物(10pmol/L)上下游引物各0.5 μl，最后補充去離子水至終體積30μl。因 PvuⅡ、XbaⅠ均位于ER-α的第1內(nèi)含子上，且其Tm值接近，故兩個基因多態(tài)性位點的擴增可采用同一引物，并可在同一條件下進行。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5min→94℃變性50s→63℃退火及復(fù)性60s，共35個循環(huán)→末次延伸，72℃10min。PCR產(chǎn)物分別進行PvuⅡ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶進行酶切，在電泳圖譜上鑒定不同的基因型。ER-α基因基因型:PCR特異性擴增片段為1300bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定ER-α的PvuⅡ和Xba I基因多態(tài)性。ER-α基因使用PvuⅡ內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)可區(qū)分出3種基因型:即基因型(終產(chǎn)物為1300bp的單一條帶)，pp基因型(終產(chǎn)物為 1300bp、850bp、450bp的3條帶)，pp基因型(終產(chǎn)物為850bp、450bp的兩條帶);用Xba I內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)可區(qū)分出3種基因型:Xx基因型(終產(chǎn)物為1300bP的單一條帶)，Xx基因型(終產(chǎn)物為 1300bp、910bp、390bp 的 3 條帶)，xx基因型(終產(chǎn)物為910bp、390bp的兩條帶)。

1.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS17.0軟件分析等位基因和基因型頻率與MS的關(guān)聯(lián)性。以χ2檢驗比較基因突變在研究組與對照組之間的差異。檢驗水準:α=0.05。采用Logistic回歸通過優(yōu)勢比及其95%可信區(qū)間(95%confidence interval，95%CI)分析各等位基因相對危險度。

2 結(jié)果

2.1 MS組和對照組Nogo基因多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率 結(jié)果顯示經(jīng)χ2檢驗基因型頻率在兩組間Nogo基因型分布差異無統(tǒng)計學意義=7.91，P=0.019 ＞0.05);MS 組和對照組 Del型等位基因頻率分別為53.33%和36.67%，經(jīng)χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異有統(tǒng)計學意義(χb2=9.11，P=0.003 ＜0.01)(見表1)。

2.2 MS組和對照組雌激素受體α PvuⅡ基因多態(tài)性基因型頻率和PvuⅡ等位基因頻率 經(jīng)χ2檢驗基因型頻率在兩組間PvuⅡ基因型分布差異有統(tǒng)計學意義(χa2=15.66，P=0.000 ＜0.01);MS 組和對照組 P型等位基因頻率分別為49.17%和28.33%，經(jīng)χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異有統(tǒng)計學意義(χb2=15.21，P=0.001 ＜0.01)(見表2)。

2.3 MS組和對照組雌激素受體α XbaⅠ基因多態(tài)性基因型頻率和XbaⅠ等位基因頻率 結(jié)果顯示經(jīng)χ2檢驗基因型頻率在兩組間XbaⅠ基因型分布差異無統(tǒng)計學意義(χa2=4.43，P=0.109 ＞0.05);MS組和對照組X型等位基因頻率分別為26.67%和20.00%，經(jīng)χ2檢驗兩組間等位基因在兩組間分布差異無統(tǒng)計學意義(χb2=2.06，P=0.151 ＞0.05)(見表3)。

2.4 單因素分析 采用單因素非條件Logistic回歸分析考查2個基因3個位點與MS發(fā)病的關(guān)系。在納入多因素年齡、發(fā)病年齡、性別、飲酒史、吸煙史、家族史及2個基因3個位點的情況下，與MS發(fā)病相關(guān)的有2個因素，即Nogo基因 Del/Del型(OR 為 1.970，95%CI為 1.151 ～ 3.372;P=0.013)和 PvuⅡ基因 PP 型(OR 為 2.664，95%CI為1.412 ～5.024;P=0.002)，都是多發(fā)性硬化的獨立危險因素。其他基因位點的多態(tài)性及因素與多發(fā)性硬化發(fā)病無關(guān)(OR 為0.663～1.585;95%CI為0.364 ～3.006，均 P ＞0.05)。

2.5 多因素分析 將單因素分析篩選出的可能危險因素進一步進行多因素Logistic回歸分析，采用似然比檢驗，通過后退法進行模型擬合，最終進入模型的因素有2個(見表4)。

表1 MS患者與對照組Nogo基因多態(tài)性基因型分布和等位基因頻率分布

表2 MS患者與對照組雌激素受體PvuⅡ基因多態(tài)性基因型頻率和PvuⅡ等位基因頻率分布

表3 MS患者與對照組雌激素受體XbaⅠ基因多態(tài)性基因型頻率和XbaⅠ等位基因頻率分布

表4 MS易感基因多態(tài)性的多因素非條件logistic回歸分析

3 討論

多發(fā)性硬化是由環(huán)境與遺傳等多因素共同作用所致，且目前認為多發(fā)性硬化是一種多基因疾病。迄今為止，關(guān)于多發(fā)性硬化的發(fā)病機制還遠未闡明。大量流行病學調(diào)查和研究證明，遺傳因素與多發(fā)性硬化發(fā)病密切相關(guān)。且國內(nèi)外均有關(guān)于基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的研究，如國內(nèi)崔玉真、肖波等［2，3］證實中國南方漢族人群CD24基因及ICOS基因多態(tài)性與MS相關(guān)，可能是MS的易感基因。本研究所涉及的基因為:Nogo基因和雌激素受體α基因。

Nogo基因定位于染色體2p12-14，長約75kb，包括14個外顯子(外顯子的長度從47bp到2400bp)及8個內(nèi)顯子(堿基長度19bp-37kb)。在bases 4386-4388有一段CAA序列結(jié)構(gòu)，這個堿基片段的插入和缺失就形成了Nogo基因的兩種等位基因型:插入型(Ins)和缺失型(Del)。通過MS組和對照組Nogo基因多態(tài)性分布比較，本研究結(jié)果提示Nogo基因多態(tài)性突變是多發(fā)性硬化發(fā)病的獨立危險因素。推測其發(fā)生機制為當Nogo基因3’端未編碼區(qū)有CAA序列插入時，即Ins型等位基因，在一定程度上降低了Nogo基因的轉(zhuǎn)錄速度，使Nogo-A蛋白產(chǎn)生減少。Del型等位基因中因為缺乏此序列，轉(zhuǎn)錄速度相對較高。故推測這兩個等位基因(Ins/Del)有一定的協(xié)同作用。也有可能是Nogo基因中片段的插入序列本身改變了mRNA前體剪接步驟，導致不同的cDNA的拼接情況，插入片段的部分序列會保存在成熟的cDNA中，影響Nogo-cDNA穩(wěn)定性，影響Nogo-A的產(chǎn)生。目前國內(nèi)外對Nogo基因多態(tài)性相關(guān)的研究不多，Gregorio等［1］研究結(jié)果認為Nogo基因3’端未編碼區(qū)CAA Ins/Del(插入/缺失)突變基因型與抑郁癥發(fā)病無相關(guān)性。Zhou等［4］就Nogo基因3’未編碼區(qū)TATC和CAA插入/缺失突變與擴張型心肌病的關(guān)系進行分析，研究發(fā)現(xiàn)TATC插入/缺失突變與擴張性心肌病有相關(guān)性。本研究前期小樣本研究［5］證實Nogo基因與多發(fā)性硬化有相關(guān)性，但是國內(nèi)外目前就Nogo基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化的相關(guān)研究尚缺乏。

人類的ER基因定位于染色體6q24-27，總共有超過14萬的堿基對，編碼蛋白由595個氨基酸組成，包括8個外顯子和7個內(nèi)含子，相對分子量為66000人類ER基因已被研究證明有3種多態(tài)性，即PvuⅡ、Xba l和BstU I。本研究通過MS組和對照組雌激素受體α基因多態(tài)性分布比較，結(jié)果提示PvuⅡ基因是多發(fā)性硬化發(fā)病的獨立危險因素。MS與ER基因多態(tài)性的關(guān)系國內(nèi)外均進行了研究。Niino等［6］對日本人群的研究表明，PvuⅡ酶切多態(tài)性與MS的發(fā)生有關(guān)，而XbaⅠ酶切多態(tài)性與MS的發(fā)病年齡有關(guān)。而意大利的一項研究表明ER基因 PvuⅡ和XbaⅠ酶切多態(tài)性與MS的發(fā)病無關(guān)［7］。本研究結(jié)果與國內(nèi)孫慶利［8］等對中國北方人群的研究結(jié)果相似，PvuⅡ酶切多態(tài)性與MS的發(fā)病有相關(guān)性，而XbaⅠ與疾病無關(guān)。這可能是由于不同種族間基因背景不同所致。ER的基因多態(tài)性在不同種族間的分布存在差異性，我國與日本人群的分布較為接近［9］，而與瑞典、美國人群中分布差異較大［10，11］本文的結(jié)果與劉浩等人的報告相似。自身免疫性疾病有一種復(fù)雜的遺傳模式，其中易感基因的相互作用時有發(fā)生。本實驗未發(fā)現(xiàn)Xba I基因與MS患病有顯著聯(lián)系，表明Xba I基因在MS發(fā)病中與Nogo基因及PvuⅡ基因無聯(lián)合作用。

綜上所述，本研究多發(fā)性硬化組與正常對照組Nogo基因和ER基因的基因型及等位基因頻率分布符合Handy-Weinberg平衡，達到遺傳平衡，具有群體代表性。用logistic回歸分析對多發(fā)性硬化3個基因位點以及臨床資料進行分析，結(jié)果顯示Nogo基因的等位基因頻率和PvuⅡ基因的基因型及等位基因頻率與MS患病的相關(guān)性，兩基因位點可能與MS易感基因相關(guān)，但這一結(jié)論有待于更大樣本的分析加以驗證。MS患者多合并情感精神障礙及生活質(zhì)量下降，且研究中發(fā)現(xiàn)多發(fā)性硬化患者的健康相關(guān)生活質(zhì)量、抑郁焦慮障礙評分等與相關(guān)臨床資料及基因型呈趨勢相關(guān)，但因樣本量仍較小，也有待更大樣本的分析加以驗證。

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