張 超， 季 暉， 趙 倩， 張珍珍

(中國藥科大學(xué)藥理學(xué)教研室，江蘇 南京 210009)

腦缺血預(yù)處理(ischemic preconditioning，IPC)是指腦組織在經(jīng)過非致死性短暫的重復(fù)缺血后，能增強其對缺血的耐受性的一種現(xiàn)象［1］。短暫性腦缺血誘導(dǎo)的腦IPC效應(yīng)是一種多因素級聯(lián)反應(yīng)，可促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)元存活，減輕缺血后損傷。一氧化氮(NO)可調(diào)節(jié)大腦血流量和局部大腦灌注時的新陳代謝活性，對IPC的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用。

1 一氧化氮與一氧化氮合酶

1.1 在腦內(nèi)的功能

NO由一氧化氮合酶(NOS)產(chǎn)生，NOS具有3種亞型:神經(jīng)型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)。在健康的大腦中，NO主要由神經(jīng)元內(nèi)的nNOS和內(nèi)皮上的eNOS產(chǎn)生。在神經(jīng)元中，nNOS主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，激活后遷移至細(xì)胞膜上，與谷氨酸鹽依賴的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體結(jié)合并激活受體［2］。NMDA受體被激活后，引起Ca2+內(nèi)流，激活nNOS產(chǎn)生較低水平的NO［3］。在損傷、缺氧等應(yīng)激條件刺激下，可誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生iNOS，且不依賴Ca2+而持續(xù)產(chǎn)生并釋放NO［4-5］。有研究者認(rèn)為在線粒體中存在著一種新的NOS——線粒體NOS(mtNOS)，但人們對此存在爭議，有人認(rèn)為所謂mtNOS可能只是線粒體中的nNOS［6］。

NO可介導(dǎo)谷氨酸鹽信號，并對細(xì)胞－細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，而谷氨酸鹽信號在長期增強或者減弱的過程中，NO可能發(fā)揮一個神經(jīng)興奮傳遞的反饋傳感器作用，這種反饋對于突觸前/后膜的興奮傳遞和神經(jīng)網(wǎng)的活性很重要。作為內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子，由eNOS和nNOS產(chǎn)生的NO可通過調(diào)節(jié)局部大腦血流量增加神經(jīng)元活性。

1.2 在腦缺血后的作用

研究表明，健康腦內(nèi)的NO濃度是納摩爾水平，然而腦缺血后其濃度升至微摩爾水平，這緣于nNOS的激活。NOS在腦缺血后的作用可被分為兩個方面，即調(diào)節(jié)血管功能(由eNOS介導(dǎo))和產(chǎn)生毒性作用(初期由nNOS介導(dǎo)，后期由iNOS介導(dǎo))。

有研究者曾在nNOS基因敲除小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，nNOS基因敲除小鼠在腦缺血后腦內(nèi)NO水平?jīng)]有增加，并對局部缺血和全腦缺血產(chǎn)生耐受。腦缺血誘導(dǎo)nNOS合成的NO對組織的損傷機制包括:致聚ADP-核糖聚合酶(PARP)激活，導(dǎo)致細(xì)胞儲存能量耗盡［7］;與超氧化物結(jié)合生成亞硝酸鹽;誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Elibol等，Neuroscience，2001 年)。與nNOS基因敲除小鼠實驗的結(jié)果一致，nNOS抑制劑也可使動物模型對缺血產(chǎn)生耐受(Yoshida等，J Cereb Blood Flow Metab，1994 年)。

已有研究表明，在腦缺血開始階段，iNOS在腦內(nèi)并無表達(dá)，直到幾天后，膠質(zhì)細(xì)胞和炎癥細(xì)胞進(jìn)入了缺血核心區(qū)，方才有表達(dá)，而由iNOS產(chǎn)生的NO則可加重組織損傷。Ono等［8］證實小膠質(zhì)細(xì)胞中因iNOS激活所產(chǎn)生并釋放的NO與缺血后延遲性神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，且使用iNOS特異性抑制劑或在iNOS基因敲除模型小鼠中進(jìn)行的實驗也證明，抑制iNOS的表達(dá)，可減輕這種損傷(Iadecola等，Neuroscience，1997 年)。

與nNOS和iNOS的毒性作用不同，eNOS在腦缺血后可發(fā)揮腦血管保護(hù)作用，即舒張血管和抑制血小板聚集及白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞黏附。實驗表明，在腦缺血后，eNOS基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，其腦內(nèi)有更大的核心缺血區(qū)和更小的半影區(qū)，這可能緣于其缺失eNOS的腦血流量調(diào)節(jié)作用(Huang等，J Cereb Blood Flow Metab，1996年)。

2 腦缺血預(yù)處理機制

IPC可出現(xiàn)在不同的組織中，如心臟、大腦、肝、肺和胃腸道片段［9-10］，但是其在各組織中的激活和調(diào)控機制是否一樣尚不得而知。IPC的一些保護(hù)機制已被證實，如改變細(xì)胞基因、上調(diào)熱休克蛋白、減少脂過氧化反應(yīng)、促進(jìn)炎癥和線粒體新陳代謝等［11-15］，但其分子機制也不十分清楚。

依據(jù)短暫性缺血后產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)的時間間隔的不同，腦IPC可分為兩種類型:即時型(early preconditioning)和延遲型(late preconditioning)，即 IPC的保護(hù)效應(yīng)呈“雙峰”時相。前者在短暫性缺血后數(shù)分鐘至3 h內(nèi)即產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)，而后者的保護(hù)效應(yīng)則出現(xiàn)在短暫性缺血后24～72 h，兩者的病理生理及保護(hù)機制不同。即時型IPC因為在短暫性缺血后很快產(chǎn)生，僅被認(rèn)為是翻譯前水平的調(diào)控，不像延遲型IPC涉及到基因表達(dá)的改變，因此其保護(hù)效應(yīng)產(chǎn)生的時間較短。

對腦IPC的研究起初采用了沙土鼠的全腦缺血模型，結(jié)果顯示，阻斷雙側(cè)頸總動脈達(dá)5 min，即可造成海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元損傷，而若在此前預(yù)先致腦形成2 min的短暫性缺血，則可減輕隨后缺血造成的CA1區(qū)神經(jīng)元損傷，提示短暫性缺血可對腦組織產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng);但這種保護(hù)效應(yīng)在1～3 d后才出現(xiàn)，說明這是一種延遲型IPC效應(yīng)。最新研究表明，NMDA受體的激活和相關(guān)蛋白的合成是延遲型IPC產(chǎn)生的必要條件［16］。

盡管IPC確切的信號分子尚不明確，但其延遲保護(hù)效應(yīng)的一些激活分子已被人們發(fā)現(xiàn)，包括腺苷、緩激肽、細(xì)胞因子、NO和活性氧(ROS)。這些分子可以激活I(lǐng)PC的上游信號，其中有些分子與NOS的激活相關(guān)，提示NO的產(chǎn)生可能是延遲型IPC效應(yīng)產(chǎn)生的關(guān)鍵。

3 對一氧化氮在腦缺血預(yù)處理中作用的研究

3.1 體外模型實驗研究

缺氧－缺糖(OGD)模型可用于對原代神經(jīng)元或PC12細(xì)胞進(jìn)行的體外模擬腦缺血研究。在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)模型中，短暫的OGD可誘導(dǎo)IPC效應(yīng)，表現(xiàn)為神經(jīng)元的抗氧化應(yīng)激能力增強。然而，細(xì)胞培養(yǎng)模型只能用來研究神經(jīng)元產(chǎn)生IPC的內(nèi)源性通路［17］，并不能闡明血管的作用和不同組織結(jié)構(gòu)之間的相互作用對IPC產(chǎn)生的影響。

體外實驗顯示，神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)5～30 min的OGD處理后，對24 h后45～55 min的OGD損傷有保護(hù)作用(Grabb等，J Neurosci，1999年)。這種IPC效應(yīng)與NMDA受體激活、Ca2+內(nèi)流和新蛋白合成相關(guān)，而L-NAME可阻斷此IPC效應(yīng)，提示NO參與了此IPC效應(yīng)的產(chǎn)生。使用原代皮層細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行的實驗還發(fā)現(xiàn)，NMDA受體興奮后，激活nNOS，導(dǎo)致NO水平升高，繼而激活可抑制Ras相關(guān)信號傳導(dǎo)的p21 Ras，產(chǎn)生IPC效應(yīng)，而使用p21 Ras顯性失活突變體或者p21 Ras抑制劑可以阻斷IPC效應(yīng)，提示下調(diào)Ras相關(guān)信號，包括Raf/MEK/ERK通路傳導(dǎo)，可能改變基因表達(dá)，并刺激神經(jīng)元生長和存活相關(guān)程序，從而誘導(dǎo)IPC效應(yīng)(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)。

3.2 體內(nèi)模型實驗研究

小鼠實驗顯示，連續(xù)將大腦中動脈阻斷(MACO)3次(每次持續(xù)5 min)，對30 min后永久性腦缺血損傷有保護(hù)作用，24 h后的腦梗死體積檢測驗證了這一點(Stagliano等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Atochin等［18］在 eNOS 和 nNOS 基因敲除及野生型小鼠實驗中采用同樣的方法考察了eNOS和nNOS在IPC中的必要性，其間采用多普勒血流儀記錄血流量變化。結(jié)果表明，野生型小鼠經(jīng)過3次MACO后，可使永久性腦缺血24 h后的腦梗死體積減少，但eNOS和nNOS基因敲除小鼠卻未見有此IPC效應(yīng)。

在新生小鼠缺氧－缺血模型中，IPC效應(yīng)可以被非特異性NOS抑制劑L-精氨酸(L-NAME)而并非nNOS特異性抑制劑7-硝基吲哚(7-nitroindazole)和iNOS特異性抑制劑氨基胍(aminoguanidine)所拮抗(Gidday 等，J Cereb Blood Flow Metab，1999 年)。Gustavsson等［19］在同一模型試驗中也證實eNOS的基因表達(dá)與腦IPC效應(yīng)相關(guān)，即eNOS基因表達(dá)的增加可致大腦血管舒張及血流量增加，從而產(chǎn)生IPC效應(yīng)。

大鼠實驗顯示，給予3 min短暫的MACO或脂多糖(LPS)，可產(chǎn)生腦IPC效應(yīng)。其中，由LPS誘導(dǎo)的IPC效應(yīng)被認(rèn)為與eNOS表達(dá)的增加有關(guān)，可被非特異性NOS抑制劑L-NAME阻斷，然而，L-NAME卻不能抑制短暫性MACO所致IPC效應(yīng)(Puisieux等，Eur J Pharmacol，2000年)。這一實驗結(jié)果與之前人們的研究結(jié)果出現(xiàn)偏差，究其原因，可能是實驗動物種群差異(大鼠 vs小鼠)、模型差異(3 min MACO 1次 vs 5min MACO 3次)和L-NAME不能有效阻斷eNOS表達(dá)所致。eNOS誘導(dǎo)腦IPC效應(yīng)的可能機制是，舒張大腦血管，增加缺血半影區(qū)血流量，從而減小腦梗死體積;且與干預(yù)白細(xì)胞－內(nèi)皮細(xì)胞以及血小板－內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用有關(guān)(Jiang等，Brain Res，2002 年)。

揮發(fā)性麻醉劑也可誘導(dǎo)腦 IPC效應(yīng)，Wang等［20］認(rèn)為這和蛋白激酶B(Akt)的激活以及三磷酸腺苷(ATP)依賴性通道等與NO密切相關(guān)的信號通路有關(guān)。給大鼠腹腔注射異氟烷或者氟烷后24 h，再行2 h MACO，則可產(chǎn)生腦IPC效應(yīng)，而iNOS抑制劑氨基胍可阻斷此IPC效應(yīng)，提示iNOS參與了這些麻醉劑誘導(dǎo)IPC效應(yīng)產(chǎn)生的過程(Kapinya等，Brain Res，2000 年)。Kitano 等［21］在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，使用異氟醚誘導(dǎo)腦IPC效應(yīng)，存在性別差異，即此誘導(dǎo)方法只對雄性小鼠有效，而對于雌性小鼠無效。這種性別差異來自于Akt的活性差異，繼而改變下游eNOS的活性。

綜上所述，NO在IPC中的作用可分為以下兩個方面:第一，可能通過內(nèi)源性通路參與IPC效應(yīng)，發(fā)揮觸發(fā)器和調(diào)控器雙重作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)元對腦缺血的耐受;第二，作為內(nèi)皮細(xì)胞衍生舒張因子，可在腦缺血后增加灌注血流量，抑制內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和白細(xì)胞的相互黏連，從而降低腦缺血所致血管功能性損傷。

4 對一氧化氮在腦缺血預(yù)處理中作用機制的研究

已有研究表明NO在IPC中的作用機制涉及以下途徑:1)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路，NO可激活這兩條通路，并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，如細(xì)胞骨架蛋白磷酸化、細(xì)胞黏附分子磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子［如Elk-1、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)、NF-κB等］的激活，而轉(zhuǎn)錄因子的激活又可以導(dǎo)致基因表達(dá)的變化，觸發(fā) IPC效應(yīng);2)NF-κB通路，NF-κB參與了由細(xì)胞因子和生長因子引起的細(xì)胞分化、凋亡和生存過程，而短暫性腦缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO可激活NF-κB，并誘導(dǎo)產(chǎn)生iNOS，引發(fā)IPC效應(yīng);3)線粒體K+-ATP通道，一種ATP敏感性的K+通道，被認(rèn)為可能是延遲型IPC的效應(yīng)器，而NO可以選擇性激動線粒體K+-ATP通道。

4.1 Ras/Raf/MEK/ERK通路

Ras/Raf/MEK/ERK通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活、凋亡的基本過程。研究表明，由nNOS產(chǎn)生的NO可激活G蛋白Ras(Gonzalez-Zulueta等，Proc Natl Acad Sci USA，2000 年)，使之結(jié)合 Ras激酶，并遷移到細(xì)胞膜表面;Ras激活絲蘇氨酸激酶Raf，繼而激活MEK激酶家族(MAPK/ERK激酶，MEK1和MEK2)，MEK又致ERK激酶家族(ERK1和ERK2，即p42和p44)磷酸化并激活，而ERK激酶是這個級聯(lián)反應(yīng)的效應(yīng)分子，不僅可致細(xì)胞質(zhì)中靶蛋白磷酸化，還可致核蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，如CREB和Elk-1磷酸化(見圖1)［16］。此外，體外神經(jīng)元培養(yǎng)模型實驗發(fā)現(xiàn)，ERK的激活與 IPC效應(yīng)相關(guān)(Kolch等，Biochem J，2000年)。筆者所在課題組進(jìn)行的大鼠實驗也顯示，IPC模型大鼠在腦缺血再灌注后腦內(nèi)磷酸化ERK(p-ERK)水平升高，而其接受新型NO供體型化合物(S)-ZJM-289治療后，IPC效應(yīng)增強，且其腦內(nèi)p-ERK表達(dá)水平進(jìn)一步提高，提示(S)-ZJM-289增強IPC效應(yīng)的作用可能與ERK蛋白的激活相關(guān)。

4.2 PI3K/Akt通路

NO激活的Ras也可通過促進(jìn)生長因子與酪氨酸激酶受體或者G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合而激活PI3K/Akt通路［15］。3-磷酸磷脂酰肌醇激酶(PI3K)被激活后，可水解細(xì)胞膜上 4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成第2信使 PIP3，而PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)結(jié)合，促使PDK致Akt磷酸化并激活(見圖1)。

Akt也稱蛋白激酶B(PKB)，是一種相對分子質(zhì)量為60000的絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有3種亞型，其中 Akt1是與大腦功能密切相關(guān)的一種亞型［22］，可在 4 個位點(Ser124、Thr308、Thr450 和Ser473)被PDK磷酸化，且Thr308和Ser473位點的磷酸化可增強Akt1激酶活性。Akt1激活后可致絲氨酸和蘇氨酸磷酸化，繼而影響諸多靶點，如基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(如 FOCO、IKK、mdm2等)、細(xì)胞質(zhì)酶、組蛋白和細(xì)胞程序化死亡相關(guān)蛋白(如BAD、Bax、Caspase 9等)。

細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加可以激活nNOS和eNOS。最近研究表明，eNOS的活性也受磷酸化的蘇氨酸和絲氨酸殘基調(diào)控，如因Ser1179位點磷酸化而激活以及因Thr479位點磷酸化而失活［23］。Akt激酶可致eNOS在Ser1179位點磷酸化并激活，是重要的體內(nèi)eNOS調(diào)控因子，其介導(dǎo)的eNOS磷酸化改變了細(xì)胞對生長因子如胰島素樣生長因子(IGF-1)的應(yīng)答。除Akt以外，其他激酶，如PKA、AMPK和PKC也可致 eNOS在不同位點磷酸化，調(diào)控其活性。eNOS活性的增加對于IPC的影響機制包括:調(diào)節(jié)Caspase的表達(dá)和磷酸化、PKC通路的激活及基因表達(dá)的改變。

總的來說，Akt1及其下游信號分子可促進(jìn)腦缺血再灌注后神經(jīng)元的存活，與IPC效應(yīng)的產(chǎn)生密切相關(guān)。

圖1 NO經(jīng)Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt通路誘導(dǎo)IPC的分子機制Figure 1 Molecular mechanism of NO-induced IPC via Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/Akt signal pathways

4.3 NF-κB 通路

在正常狀態(tài)下，NF-κB在胞質(zhì)中與其抑制因子I-κB結(jié)合而失去轉(zhuǎn)錄活性。短暫性腦缺血后產(chǎn)生的適量的NO則能促進(jìn)PKC致IKK(I-κB的激酶)磷酸化并激活，導(dǎo)致 I-κB磷酸化及降解，使其與NF-κB 解離［24-25］，被釋放的 NF-κB 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)并誘導(dǎo)目的基因表達(dá) iNOS，激活 CREB［16］，并產(chǎn)生IPC效應(yīng)(見圖2)。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，(S)-ZJM-289用于IPC模型大鼠時，可改善大鼠的神經(jīng)行為學(xué)功能和腦損傷指標(biāo)。且免疫組化和Western Blot實驗顯示，給IPC模型大鼠使用了(S)-ZJM-289后，大鼠腦內(nèi)NF-κB和eNOS蛋白表達(dá)上調(diào)，表明(S)-ZJM-289可通過激活eNOS，釋放NO，促進(jìn)NF-κB-I-κB解偶聯(lián)，致NF-κB 活化并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行iNOS基因轉(zhuǎn)錄，從而增強IPC效應(yīng)。

圖2 NO經(jīng)NF-κB通路誘導(dǎo)IPC的分子機制Figure 2 Molecular mechanism of NO-induced IPC via NF-κB singal pathway

4.4 線粒體K+-ATP通道

線粒體K+-ATP通道是腦內(nèi)產(chǎn)生IPC的重要靶點，而PKC的激活被認(rèn)為是線粒體K+-ATP通道開放的重要環(huán)節(jié)［26］。已有研究顯示，給IPC模型大鼠在腦缺血前注射K+-ATP通道拮抗劑，可阻斷腦缺血后IPC效應(yīng)，而K+-ATP通道激動劑在海馬切片中可誘導(dǎo)類似IPC效應(yīng)［27］;NO則可通過環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)-PKG-PKC通路選擇性激動線粒體K+-ATP通道［28-29］。最新研究表明，硝?；蛶€基等自由基也可激動該通道［30］。機制研究表明，線粒體K+-ATP通道的開放可抑制細(xì)胞膜去極化［31］，增加線粒體呼吸率(Bajgar等，J Biol Chem，2001)，減少ROS產(chǎn)生［32］，抑制胞內(nèi)鈣的超載，從而抑制神經(jīng)元凋亡，產(chǎn)生 IPC 效應(yīng)(Pain等，Circ Res，2000 年)。

5 結(jié)語

NO及其代謝物在細(xì)胞保護(hù)分子信號級聯(lián)中起重要作用，可促進(jìn)IPC效應(yīng)的產(chǎn)生，對其的深入研究有積極的臨床意義。筆者所在課題組研究表明，新型NO供體型化合物(S)-ZJM-289用于IPC大鼠時，可顯著性降低腦缺血再灌注后的神經(jīng)元損傷和腦梗死體積，改善神經(jīng)學(xué)功能，其誘導(dǎo)IPC效應(yīng)的產(chǎn)生與增強eNOS活性和改善線粒體功能相關(guān)，它可通過增加eNOS活性，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，增強腦內(nèi)缺血區(qū)域的微循環(huán)，促使ERK磷酸化，導(dǎo)致IPC效應(yīng)的產(chǎn)生。亞硝酸鹽是本課題組最新的研究重點，因為它不僅是一種穩(wěn)定的NO貯存器，能在缺血后對缺血區(qū)域發(fā)出類似NO的信號，其具有的氧化還原特性又令它在這個信號通路中的作用具有多樣性，而且它還是IPC效應(yīng)調(diào)節(jié)器，在治療腦缺血再灌注損傷方面極具潛在價值。盡管亞硝酸鹽介導(dǎo)IPC效應(yīng)的機制尚不清楚，但現(xiàn)有的研究數(shù)據(jù)表明，它是缺血反饋的生理調(diào)節(jié)器，為治療缺血性疾病的很有潛力的藥物。

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