李建生 王守富 張慧儉 秦金利 李素云 余海濱 王 峰 李 亞 劉四化

(河南中醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所，河南 鄭州 450008)

Toll樣受體4(TLR4)是近年來(lái)逐漸明確的模式識(shí)別受體，主要介導(dǎo)內(nèi)毒素(LPS)信號(hào)從細(xì)胞外至細(xì)胞內(nèi)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明其表達(dá)量與前炎癥因子釋放量直接相關(guān)〔1，2〕。過(guò)度炎癥反應(yīng)則導(dǎo)致細(xì)胞組織損傷，引起臟器功能障礙或衰竭。而有關(guān)TLR4在老年多器官功能障礙綜合征(MODS)發(fā)病中所起作用研究較少，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步探討TLR4在老年感染性多器官損傷發(fā)病中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD老齡雄性大鼠(21月齡)，55只，體重(550±70)g;SD青年雄性大鼠(6月齡)，25只，體重(200±20)g，均由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):XK20050001。

1.1.2 試劑 肺炎克雷伯桿菌由中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所提供，種系號(hào):K46114，使用前用無(wú)菌生理鹽水稀釋至1.2×1010cfu/ml。RT-PCR相關(guān)試劑:Trizol為Invitrogen公司提供，批號(hào):1334257。RT-PCR一步法試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司提供，批號(hào):BK3601。TLR4、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)、親免疫性蛋白(CD14)和白介素受體相關(guān)激酶(IRAK-1)mRNA及內(nèi)參由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成，訂單號(hào):70714600，70614601。免疫組織化學(xué)抗體:TLR4和核轉(zhuǎn)移因子(NF-κB)單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供，批號(hào):BA1717和BA0610。瓊脂糖由英國(guó)OXOID LIMITED BASINGSTOKE提供，批號(hào):889970-02。

1.2 方法

1.2.1 模型與分組 按李建生等〔3〕報(bào)道的方法復(fù)制大鼠多器官損傷模型。模型成功標(biāo)準(zhǔn)參照胡森等主編的《多器官功能障礙綜合征》提出的動(dòng)物MODS時(shí)器官功能障礙分期診斷及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)〔4〕。老齡大鼠35只分為2組，老齡對(duì)照組10只、老齡模型組25只;青年大鼠25只分為2組，青年對(duì)照組10只、青年模型組為15只。造模48 h后處死動(dòng)物。無(wú)菌留取動(dòng)物肺、心、小腸組織進(jìn)行TLR4信號(hào)通路相關(guān)分子基因表達(dá)檢測(cè)。

1.2.2 TLR4信號(hào)通路主要指標(biāo)檢測(cè)

1.2.2.1 TLR4、LBP、CD14及IRAK-1 mRNA表達(dá)的檢測(cè) 采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定 TLR4、LBP、CD14及 IRAK mRNA表達(dá)。TLR4引物序列 (擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為560 bp):5'-TCATCAGTGTATCGGTGGTC-3'(上游)，5'-TTTCATCTGGATTCAAGGCT-3'(下游)。LBP引物序列(擴(kuò)增片段為789 bp):5'-CAAACTCTGCCAGTCACA-3'(上游)，5'-GGACATTGGCACCCAAGT-3'(下游)。CD14引物序列(擴(kuò)增片段為468 bp):5'-GTTGCTGTTGCCTTTGAC-3'(上 游)，5'-AGCCAGGTATCCGTTCTT-3'(下游)。IRAK-1引物序列(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為243 bp):5'-CATGTGCCTACTGCCTGCTA-3'(上游)，5'-ACCCTGGGTGACTTGTGAAG-3'(下游)。3'-磷酸甘油脫氫酶(GAPDH)引物序列(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為309 bp):5'-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3'(上游)，5'-AGATCCACAACGGATACATT-3'(下游)。應(yīng)用 Trizol試劑，提取肺、心、小腸組織總RNA，RNA經(jīng)電泳證實(shí)28 S亞基為18 S亞基的2倍，且A260/A280≥1.8。按TaKaRa RT-PCR一步法試劑盒說(shuō)明書(shū)配制RT-PCR反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為:50℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 30 min，94℃預(yù)變性 3 min;94℃ 35 s，55℃ 35 s，72℃55 s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。取5 μl PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察，采用Silver UVI proGA凝膠成像系統(tǒng)成像，進(jìn)行半定量分析，通過(guò)目的基因與內(nèi)參對(duì)照的積分光密度比值表示mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2.2 TLR4、TRAF6和NF-κB活性檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)(SP)法檢測(cè)。免疫組化染色結(jié)果分析方法:光鏡下觀察，在400倍視野下，細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕色為免疫組化陽(yáng)性。以光鏡觀察，用Image-Pro Plus 5.1專業(yè)圖像采集與分析系統(tǒng)采集圖像，并進(jìn)行半定量分析。每張切片隨機(jī)選取不重疊的5個(gè)視野拍照，測(cè)定其平均光密度值及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值代表各細(xì)胞因子的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料用±s表示，各組間比較用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布者進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化后比較。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠臟器組織LBP mRNA表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織LBP mRNA表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組肺、心組織表達(dá)又強(qiáng)于青年模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠臟器組織CD14 mRNA表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織CD14mRNA表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增強(qiáng)(P＜0.01，P＜0.05)，老齡模型組肺、小腸組織則強(qiáng)于青年模型組(P＜0.01，P＜0.05)。見(jiàn)表2。2.3 各組大鼠臟器組織TLR4 mRNA表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TLR4 mRNA表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增強(qiáng)(均P＜0.01)。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠肺、心和小腸組織LBP mRNA的表達(dá)(x ± s，n=10)

表2 各組大鼠肺、心和小腸組織CD14 mRNA的表達(dá)(x ± s，n=10)

表3 各組大鼠肺、心和小腸組織TLR4 mRNA表達(dá)變化(x ± s，n=10)

2.4 各組大鼠臟器組織TLR4蛋白表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TLR4蛋白表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增高(均P＜0.01)，老齡模型組肺、心組織TLR4光密度和小腸組織陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)則較青年模型組顯著增高(P＜0.05或P＜0.01)。見(jiàn)表4。

2.5 各組大鼠臟器組織IRAK-1 mRNA表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織IRAK-1 mRNA表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增強(qiáng)(均P＜0.01)，老齡模型組心組織表達(dá)則強(qiáng)于青年模型組(均P＜0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表5。

表4 各組大鼠肺、心、小腸組織TLR4表達(dá)變化(± s，n=10)

組別 肺陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度心陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度小腸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度青年對(duì)照組 19.50±16.51 0.340±0.047 18.00±13.62 0.246±0.010 7.29±6.98 0.230±0.167青年模型組 175.96±21.102) 0.442±0.03672)3) 194.56±22.102) 0.324±0.0232)4) 146.10±21.352)3) 0.568±0.2422)老齡對(duì)照組 29.25±21.194) 0.421±0.0354) 21.57±12.684) 0.284±0.0104) 17.33±13.674) 0.298±0.2884)老齡模型組 173.53±22.00 0.584±0.025 190.78±19.65 0.410±0.017 180.94±20.62 0.692±0.230

2.6 各組大鼠臟器組織TRAF6蛋白表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織TRAF6蛋白表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增高(均P＜0.01)，老齡模型組心臟組織TRAF6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較青年模型組顯著增高(均P＜0.05)。見(jiàn)表6。

2.7 各組大鼠臟器組織NF-κB蛋白表達(dá)變化 老齡模型組和青年模型組肺、心、小腸組織NF-κB蛋白表達(dá)分別較老齡對(duì)照組和青年對(duì)照組明顯增高(P＜0.01或P＜0.05)，老齡模型組肺、心、小腸組織蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和心組織積分光密度顯著高于青年模型組(均P＜0.01)。見(jiàn)表7。

表5 各組大鼠肺、心和小腸組織IRAK-1 mRNA表達(dá)變化(± s，n=10)

表5 各組大鼠肺、心和小腸組織IRAK-1 mRNA表達(dá)變化(± s，n=10)

組別 肺 心 小腸青年對(duì)照組0.476±0.256 0.347±0.208 0.405±0.293青年模型組 0.930±0.3442) 0.794±0.2292)3) 0.953±0.2422)老齡對(duì)照組 0.529±0.2784) 0.415±0.3434) 0.533±0.2174)老齡模型組1.071±0.225 1.176±0.259 1.008±0.198

表6 各組大鼠肺、心、小腸組織TRAF6表達(dá)變化( ± s，n=10)

表6 各組大鼠肺、心、小腸組織TRAF6表達(dá)變化( ± s，n=10)

組別 肺陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度心陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度小腸陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 平均光密度青年對(duì)照組 23.32±22.66 0.350±0.080 9.43±9.07 0.192±0.036 11.29±9.52 0.205±0.016青年模型組 249.41±30.882) 0.575±0.0802) 187.53±12.722)3) 0.339±0.0382) 135.36±14.672) 0.293±0.0112)老齡對(duì)照組 30.00±24.044) 0.400±0.0854) 19.13±12.694) 0.207±0.0384) 23.16±15.014) 0.207±0.0144)老齡模型組 231.67±30.82 0.511±0.085 222.08±14.36 0.389±0.112 166.27±14.62 0.303±0.010

表7 各組大鼠肺、心、小腸組織NF-κB表達(dá)變化(x ± s，n=10)

3 討論

老年MODS的發(fā)病誘因以感染最為常見(jiàn)，引起感染致病菌主要是革蘭陰性菌，而革蘭陰性菌的主要致病因子是LPS。TLR4是LPS的跨膜受體，其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由主要LBP、CD14、TLR4、IRAK-1、TRAF6和NF-κB等相關(guān)分子組成，它介導(dǎo)了LPS誘導(dǎo)的機(jī)體炎癥反應(yīng)。TLR4在老年MODS發(fā)病中變化規(guī)律和作用則需進(jìn)一步明確。

肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，LPS為其主要致病因子，LPS需通過(guò)LBP而發(fā)揮致炎作用。LBP是一種由肝臟合成和分泌的血漿蛋白，LBP與LPS在炎癥反應(yīng)急性期血清或單純LBP與LPS在體外混合后可以高親和力結(jié)合，借以將LPS傳遞給CD14，形成CD14-LPS復(fù)合體。LPS正是借助LBP的轉(zhuǎn)移、遞呈和催化作用而激活下游分子的〔5，6〕。本研究表明，模型組肺、心、小腸組織LBP、CD14 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，增強(qiáng)高的達(dá)5倍多;并且老齡模型肺、心組織LBP mRNA表達(dá)和肺、小腸組織CD14 mRNA表達(dá)又較青年模型增高顯著，提示LBP和CD14參與了感染性多器官損傷。LBP、CD14表達(dá)增強(qiáng)則進(jìn)一步激活下游分子，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。Bochkov〔7〕等應(yīng)用氧化磷脂阻斷LPS、LBP和CD14，抑制了LPS誘導(dǎo)的NF-κB介導(dǎo)的炎癥基因表達(dá)上調(diào)。在注入LPS的小鼠，氧化磷脂抑制炎癥并保護(hù)小鼠，使之避免死于致命的內(nèi)毒素休克?？梢?jiàn)，LBP和CD介導(dǎo)了老年感染性多器官損傷。

TLR是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫受體，其分布十分廣泛，主要表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、多形核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及自然殺傷細(xì)胞等表面，屬于模式識(shí)別受體，可對(duì)病原體相關(guān)分子模式進(jìn)行識(shí)別、結(jié)合，并引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而導(dǎo)致炎性介質(zhì)的釋放，在天然免疫防御中起著重要作用，并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)〔8，9〕。目前，TLR家族成員至少有11個(gè)(TLR1～TLR11)，其中LPS引起的組織損傷主要有TLR4介導(dǎo)，國(guó)外有不少學(xué)者認(rèn)為許多疾病與TLR4有著密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明肺、心、小腸組織TLR4表達(dá)老齡、青年模型組表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，提示TLR4參與了感染性多器官損傷。既往研究顯示LPS引起急性肺損傷時(shí)，肺巨噬細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，腫瘤壞死因子(TNF-α)分泌增多，說(shuō)明TLR4參與肺組織炎癥反應(yīng)，其機(jī)制可能是通過(guò)增加TLR4的表達(dá)而使TNF-α等炎癥因子分泌增多所致。G－菌LPS性休克在感染性休克中大致占50%，在對(duì)G－菌及其產(chǎn)物的識(shí)別中，TLR4起著非常重要的作用。當(dāng)TLR4與配體結(jié)合后，激活NF-κB并上調(diào)TNF等細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的炎性反應(yīng)，達(dá)到殺傷病原體的目的。但是過(guò)強(qiáng)的炎性反應(yīng)將加重組織器官的損害，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，最終導(dǎo)致G－菌LPS性休克〔10〕。Ruemmele等〔11〕報(bào)道腸上皮細(xì)胞在 TLR4調(diào)節(jié)下分泌內(nèi)源性TNF，引起腸炎?？梢?jiàn)，TLR4參與了老年感染性多器官損傷，并在其中發(fā)揮了非常重要的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，老齡模型肺、心、小腸組織TLR4蛋白表達(dá)較青年模型明顯增強(qiáng)，這可能是導(dǎo)致老年臟器損傷較青年重的機(jī)制之一。由于TLR4表達(dá)較強(qiáng)，其激活NF-κB和c-Jun氨基末端激酶(JNK)更明顯，結(jié)果導(dǎo)致更多炎性因子和炎癥介質(zhì)分泌，引起組織損傷。

最近研究表明，IRAK-1在IL-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的調(diào)控作用，這種早期信號(hào)分子為白細(xì)胞介素(IL-1)活化NF-κB所必需〔12〕。TRAF6是多種生理過(guò)程的信號(hào)調(diào)節(jié)分子，先天性和獲得性免疫、骨代謝、淋巴結(jié)發(fā)育、乳腺發(fā)育甚至皮膚和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育無(wú)不與TRAF6密不可分。作為接頭分子，激活NF-κB和JNK〔13〕。本研究顯示肺、心、小腸組織模型組IRAK-1和TRAF6 mRNA表達(dá)較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，老齡心組織表達(dá)較青年更為顯著，提示IRAK-1和TRAF6作為T(mén)LR下游分子參與了老年多臟器損傷的病理生理過(guò)程。

NF-κB 通過(guò)調(diào)控編碼細(xì)胞因子 (如 IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α)、黏附分子、急性期蛋白和多種酶類(如誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、環(huán)氧化酶)基因的表達(dá)，進(jìn)而參與炎癥反應(yīng)放大和延續(xù)，在膿毒癥的發(fā)生過(guò)程中起非常關(guān)鍵作用〔14，15〕。臨床觀察顯示，術(shù)后發(fā)生MODS患者中性粒細(xì)胞NF-κB活性顯著增高。實(shí)驗(yàn)研究用NF-κB抑制劑能顯著抑制膿毒性休克大鼠肺組織一氧化氮合酶基因表達(dá)，并呈劑量依賴性;同時(shí)可明顯減輕LPS引起的動(dòng)脈血壓下降，表明NF-κB活化參與了機(jī)體失控性炎癥反應(yīng)與器官損害的病理生理過(guò)程〔16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肺、心、小腸組織模型組NF-κB表達(dá)較對(duì)照組明顯增高，說(shuō)明NF-κB參與細(xì)菌性肺炎所致之多器官損傷，并發(fā)揮了重要作用。由于老齡大鼠臟器組織NF-κB的活性較青年增高顯著，可能導(dǎo)致更多的炎癥因子和炎癥介質(zhì)合成和釋放，結(jié)果臟器損傷老年較青年為重。當(dāng)然，老年臟器損傷重，亦可能與增齡因素有關(guān)。

1 Hoshino K，Takeuchi O，Kawai T，et al.Cutting edge:Toll-like receptor 4(TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide:evidence for TLR4 as the Lpsgene product〔J〕.J Immunol，1999;162(7):3749-52.

2 Tsujimoto H，Ono S，Efron PA，et al.Role of toll-like receptors in the development of sepsis〔J〕.Shock，2008;29(3):315-21.

3 李建生，王守富，秦金利，等.克雷伯桿菌肺炎老齡大鼠多器官損傷模型的建立〔J〕.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2009;21(4):226-9.

4 胡 森，盛志勇.多器官功能障礙綜合征〔M〕.北京:科學(xué)出版社，1999:186-204.

5 Frantz S，Ertl G，Bauersachs J.Mechanisms of disease:Toll-like receptors in cardiovascular disease〔J〕.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2007;4(8):444-54.

6 Verstak B，Hertzog P，Mansell A.Toll-like receptor signalling and the clinical benefits that lie within〔J〕.Inflamm Res，2007;56(1):1-10.

7 Bochkov VN，Kadl A，Huber J，et al.Protective role of phospholipid oxidation products in endotoxin_induced tissue damage〔J〕.Nature，2002;419(6902):77-81.

8 Akira S.Mammalian Toll-like receptors〔J〕.Curr Opin Immuno1，2003;15(2):5-11.

9 Akira S，Uematsu S，Takeuehi O.Pathogen recognition and innate immunity〔J〕.Cell，2006;124(4):783-801.

10 Knuefermann P，Nemoto S，Baumgarten G，et al.Cardiac inflammation and innate immunity in septic shock:is there a role for Toll-like receptors〔J〕?Chest，2002;121(4):1329-36.

11 Ruemmele FM，Beaalieu JF，Dionne S，et al.Lipopolysaccharide modulation of normal enterocyte turnover by Toll-like receptors is mediated by endogenously produced tumour necrosis factor alpha〔J〕.Gut，2002;51(6):842-8.

12 Huang YS，Misior A，Li LW.Novel role and regulation of the interleukin-1 receptorassocia-ted kinase(IRAK)family proteins〔J〕.Cell Mol Immunol，2005;2(1):36-9.

13 Zapata JM，Lefebvre S，Reed JC.Targeting TRAfs for therapeutic intervention〔J〕.Adv Exp Med Biol，2007;597:188-201.

14 Hayden MS，Ghosh S.Shared principles in NF-κB signaling〔J〕.Cell，2008;132(3):344-62.

15 Tergaonkar V.NFkappaB pathway:a good signaling paradigm and therapeutic target〔J〕.Int J Biochem Cell Biol，2006;38(10):1647-53.

16 蔣建新，姚詠明，鄭 江.細(xì)菌內(nèi)毒素基礎(chǔ)與臨床〔M〕.北京:人民軍醫(yī)出版社，2004:129.