由莉越 ，遲淑萍 ，汪 辰 ，孫 杰 ，周婷婷 ，陳紅鴿 ，趙慶國 ，程 云 *

1.解放軍第三〇二醫(yī)院藥學部，北京 100039；2.軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京 100850

丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒（HCV）所引起，是危害人類健康的重要疾病之一，其中有很大一部分患者最終發(fā)展為肝硬化和肝癌[1]。長期以來，對于丙型肝炎慢性化和肝損傷的機制一直都在探討之中[2]，在丙型肝炎的診斷和預(yù)后效果判斷的過程中，肝生化指標的測定結(jié)果具有很重要的參考價值。此外，細胞因子重組人干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、 腫瘤壞死因子 α （tumor necrosis factor，TNF-α）、重組人白介素10（interleukin-10，IL-10）都是細胞免疫應(yīng)答過程中合成分泌的細胞因子，它們同其他細胞因子形成細胞因子網(wǎng)絡(luò)，對免疫應(yīng)答進行調(diào)節(jié)，同時也參與炎癥反應(yīng)，是重要的炎癥介質(zhì)。本研究采用酶聯(lián)接免疫吸附劑測定（ELISA）方法檢測丙型肝炎患者血清中IFN-γ、IL-10、TNF-α的表達水平，探討3種細胞因子之間以及其與生化變量之間的相關(guān)性，有助于進一步了解HCV引起肝臟損傷的機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

慢性HCV感染者的66份外周血均采自解放軍第三〇二醫(yī)院2005年1月～2006年1月的住院確診的患者。其中，男32 例，女 34例；年齡 7～77 歲，平均（51.5±18.5）歲；27 例有輸血史。HCV感染的診斷根據(jù)血清抗-HCV和（或）HCV RNA檢測陽性。按照2005年第11次全國病毒性肝炎會議修訂的診斷標準，將患者分為輕度慢性肝炎33例，中重度慢性肝炎8例，代償期肝硬變13例，失代償期肝硬變12例。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）提取后，將分離所得PBMCs用含有100 ml/L的混合人血清的完全RPMI 1640培養(yǎng)，稀釋細胞使其終濃度為5×107/ml，以100 μl/孔加入96孔板，37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，72 h后收集培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測上清細胞因子IFN、IL-10、TNF-α的含量。操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.2 以患者血清為模板，提取HCV RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后在AG-600型DNA擴增儀上進行兩輪巢式PCR循環(huán)，具體的PCR引物以及擴增條件參考我院之前的研究結(jié)果[3]，最后利用PE 310全自動遺傳分析儀進行序列測定。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對各生化變量之間、各細胞因子之間以及各生化變量與各細胞因子之間的相關(guān)性進行皮爾森（Pearson）相關(guān)性分析。統(tǒng)計結(jié)果相關(guān)系數(shù)≥0.8，高相關(guān)性；0.5≤相關(guān)系數(shù)<0.8，中相關(guān)性；0.3≤相關(guān)系數(shù)<0.5，低相關(guān)性；相關(guān)系數(shù)<0.3，非常低相關(guān)性，可以認為不相關(guān)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標檢測結(jié)果

本研究共檢測生化指標8項，其中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、 天門冬酸氨基轉(zhuǎn)換酶 （AST）、ALT/AST、總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、清蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）七項指標檢測了66例患者，CHE指標檢測了46例患者，各變量檢測結(jié)果，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。各指標檢測結(jié)果如下：ALT（81.0±72.4）U/L、AST（65.2±46.5）U/L、ALT/AST（0.95±0.47）、TBIL（12.95±6.31）U/L、DBIL（3.09±2.16）U/L、ALB（44.14±3.03）U/L、GLO（30.24±5.78）U/L、CHE（7108.6±1724.3）U/L。

2.2 細胞因子檢測結(jié)果

在本研究中檢測了3種細胞因子的表達水平，66例患者中有34例檢測了細胞因子IFN-γ及IL-10表達水平，同時該34例患者中有33例同時檢測了細胞因子TNF-α的表達水平。結(jié)果顯示IFN-γ表達的平均水平為（76.9±112.3）ng/L，IL-10 表達的平均水平為（1596.4±1313.4）ng/L，TNF-α 平均表達水平為（4253.8±4557.4）ng/L。

2.3 各生化變量與細胞因子間的相關(guān)性分析

各生化變量與細胞因子間的相關(guān)性較差，除GLO與TNF-α在 0.05置信水平上有較低相關(guān)性 （r=-0.287，P=0.046）之外（圖1），丙肝患者各血生化指標與各炎癥細胞因子之間無顯著相關(guān)性（P＜0.05）。

圖1 GLO-TNF相關(guān)性散點圖

2.4 各生化指標之間的相關(guān)性分析

通過各生化指標之間的相關(guān)性分析可以看出各指標之間存在微弱互相關(guān)性。其中ALT與AST具有顯著相關(guān)性（r=0.869，P=0），但是做除法后（ALT/AST）相關(guān)性基本被消除，僅存在ALT與ALT/AST的中度相關(guān)（r=-0.370，P=0.002）。另外，ALT與GLO在0.05水平正相關(guān)，但是相關(guān)性非常低 （r=0.283，P=0.021）。對于AST而言，除了與ALT高度相關(guān)之外，還與 DBIL（r=0.281，P=0.022）和 GLO（r=0.427，P=0）具有相關(guān)性；對于ALT/AST而言，除與ALT中度相關(guān)外，還與CHE在0.01 水平呈負相關(guān)（r=-0.417，P=0.004），但相關(guān)性低；對于TBIL 而言，與 DBIL 在 0.01水平呈正相關(guān)（r=0.732，P=0），且為中度相關(guān)性；對于ALB而言，與GLO在0.01水平呈負相關(guān)（r=-0.461，P=0），且相關(guān)性低。

2.5 細胞因子間的相關(guān)性分析

細胞因子間的相關(guān)性分析顯示除IFN-γ與TNF-α之間存在弱相關(guān)性（r=0.448，P=0.009）之外（圖 2），各細胞因子表達水平之間無明顯相關(guān)性（P＜0.05）。

3 討論

圖2 IFN-TNF相關(guān)性散點圖

丙型肝炎是由丙肝病毒所引發(fā)，通過輸血或血制品、血透析、腎移植、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染引起的。有研究證明，HCV感染者病程進展與諸多因素有關(guān)，包括性別、感染HCV的年齡、過度飲酒、脂肪變性、合并感染HBV/HIV、免疫抑制（如器官移植）等[4-5]。在臨床診斷其疾病以及疾病發(fā)展過程中，肝功能檢查是很重要的一項判斷指標。Zechini等[6]認為，ALT水平，特別是AST的水平，與肝損傷的程度有關(guān)。而有研究[7]則認為，肝損傷程度與臨床癥狀、ALT水平、HCV基因型和病毒載量不相關(guān)。Anand等[8]和Rehermann[9]報道在慢性丙型肝炎患者中AST/ALT比值是判斷纖維化分期和肝硬化的一個獨立指標，當AST/ALT≥1時，高度提示肝硬化的存在。慢性肝炎中度以上、肝硬化、重型肝炎時出現(xiàn)白蛋白下降，γ球蛋白升高，白/球（A/G）比例下降甚至倒置。一般情況下，肝損程度與膽紅素含量呈正相關(guān)。DBIL在TBIL中的比例尚可反映淤膽程度。本研究中，對各生化變量之間進行相關(guān)性分析后，除了ALT與AST具有高顯著相關(guān)性之外，其余的生化變量之間存在弱的相關(guān)性，而且在對ALT、AST做除法后（ALT/AST）相關(guān)性基本被消除，這就提示在對疾病作判斷時不能單純地看某一指標，必須綜合考慮。

以往的研究認為慢性丙型肝炎肝損傷的發(fā)病機制是HCV與宿主免疫反應(yīng)之間相互作用的結(jié)果[9]。細胞免疫在HCV感染中具有雙重作用，HCV感染機體后，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的Th1類細胞因子，其中就包括IFN-γ和TNF-α，這兩種細胞因子同時具有抗病毒和誘發(fā)炎癥的作用，雖然不足以清除病毒，但仍可誘導(dǎo)機體的肝臟損傷[10]。Yoshioka等[11]研究發(fā)現(xiàn)，過量的TNF與暴發(fā)型病毒性肝炎和慢性活動性肝炎相關(guān)，其本身對感染的肝細胞也有直接的溶解破壞作用。以往的研究也顯示，IFN-γ在清除病毒中起重要作用，TNF-α是引起肝臟損傷的重要因素之一[12]。IL-10屬于細胞因子中的干擾素家族，最初認為是由Th2淋巴細胞分泌的，能抑制 Th1 細胞合成 IFN-γ、白介素 2（interleukin-2，IL-2），故曾被命名為細胞因子合成抑制因子 （cytokine synthesis inhibiting factor，CSIF）。IL-10也能抑制炎癥因子的合成與釋放，de Waal等[13]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性與外源性IL-10均能在轉(zhuǎn)錄水平強烈抑制 IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α 的合成，從而起到抗炎癥的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IFN與TNF之間存在弱相關(guān)性，而且球蛋白（GLO）與TNF在0.05置信水平上有較低相關(guān)性。提示IFN與TNF可以相互誘導(dǎo)表達，以促進HCV的清除，同時，TNF的表達引起肝臟損害的機制可能是通過GLO這個生化指標表現(xiàn)出來。為了更好地分析各生化變量及細胞因子之間的關(guān)系，下一步筆者將擴大樣品數(shù)，以進行更深入細致的分析。

[1]Seeff L.Natural history of viral hepatitis,type C[J].Semin Gastrointest Dis,1995,6(1):20-27.

[2]Alberti A,Benvegnu L.Management of hepatitis C[J].J Hepatol,2003,38(suppl):S104-S118.

[3]趙軍.北京地區(qū)46例II型/1b型HCV高變區(qū)1的序列變異研究[J].中華肝臟病雜志,1999,7(2):88-90.

[4]Leone N,Rizzetto M.Natural history of hepatitis C virus infection:from chronic hepatitis to cirrhosis,to hepatocellular carcinoma [J].Minerva Gastroenterol Dietol,2005,51(1):31-46.

[5]Orellana NI,Poniachik TJ,Smok SG,et al.Factors associated with the severity of liver damage in chronic hepatitis C[J].Rev Med Chil,2005,133(11):1311-1316.

[6]Zechini B,Pasquazzi C,Aceti A.Correlation of serum aminotransferases with HCV RNA levels and histological findings in patients with chronic hepatitis C:the role of serum aspartate transaminase in the evaluation of disease progression[J].Eur J Gastroenterol Hepatol,2004,16(9):891-896.

[7]譚龍益,張莉,王皓,等.HCV RNA含量與肝臟組織病理學損傷之間的關(guān)系[J].第二軍醫(yī)大學學報,2004,25(12):1307-1309.

[8]Anand BS,Velez M.Assessment of correlation between serum titers of hepatitis C virus and severity of liver disease[J].World J Gastroenterol,2004,10(16):2409-2411.

[9]Rehermann B.Interaction between the hepatitis C virus and the immune system[J].Semin Liver Dis,2000,20(2):127-141.

[10]Sun J,Li K,Shata MT,et al.The immunologic basis for hepatitis C infection[J].Currop in Gastroenterol,2004,20(6):598-602.

[11]Yoshioka K,Kakumu S,Arao M,et al.Immunohistochemical studies of intrahepatic tumor necrosis factor alpha in chronic liver disease [J].J Chin Pathol,1990,43(4):298-302.

[12]李躍旗,徐鵬輝,蘇海濱,等.慢性HCV感染患者PBMC體外Th1類細胞因子分泌及其相關(guān)因素分析[J].第四軍醫(yī)大學學報,2007,28(9):843-845.

[13]De Waal MR,Abrams J,Bennett B.Interleukin 10(IL-10)inhibits cytokine synthesis by human monocytes:an autoregulatory role of IL-10 ptoduced by monocytes[J].J Exp Med,1991,174(5):1209-1220.