李 寧，張雪霞，李曉露，王海燕，林 毅，蔣 沁

(微生物藥物國家工程研究中心，河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北 石家莊 050015)

格爾德霉素(Geldanamycin)屬于苯醌安莎霉素類，它的結(jié)構(gòu)特征是一個苯醌部分與一個平面性大環(huán)安莎橋相連[1]。具有抗原蟲、抗細(xì)菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。格爾德霉素通過特異性結(jié)合并抑制熱休克蛋白90(Hsp90)，起到抑制腫瘤細(xì)胞和抗病毒的作用[2，3]?；瘜W(xué)家們合成得到了一些具有較高抗腫瘤活性的格爾德霉素衍生物，已進(jìn)入Ⅱ期臨床試驗(yàn)，有望成為新的抗腫瘤藥物[4]。

目前已知的格爾德霉素純化方法[5]，多采用反復(fù)提取、樹脂吸附、萃取、層析、結(jié)晶等過程，步驟繁瑣，收率低。作者采用聚合物納米微球?qū)Ω駹柕旅顾匕l(fā)酵菌絲體的浸提濃縮物直接進(jìn)行層析純化，得到高純度格爾德霉素，簡化了工藝過程，提高了成品收率，質(zhì)量可控，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試藥、試劑與儀器

格爾德霉素發(fā)酵液，華北制藥新藥公司。

格爾德霉素對照品，Sigma公司；聚合物納米微球，蘇州納微科技公司；乙腈，色譜純，Merck公司；雙蒸餾水，自制；乙醇，國產(chǎn)分析純。

中壓層析系統(tǒng)(C-601泵，C-615控制器，C-616收集器，C-635檢測器)，瑞士Büchi公司；高效液相色譜儀(515泵，2996檢測器)，美國Waters公司。

1.2 發(fā)酵液預(yù)處理

格爾德霉素存在于菌絲體內(nèi)。在發(fā)酵液中加入3%(質(zhì)量體積比，g∶mL)的珍珠巖，攪拌30 min后過濾，水洗，得格爾德霉素菌絲體。向其中加入3倍(體積質(zhì)量比，mL∶g，下同)95%乙醇，攪拌浸提1 h，過濾，得浸提液；向浸提后的菌絲體中再加入1倍95%乙醇，攪拌浸提1 h，過濾，得二次浸提液；合并浸提液，40 ℃減壓濃縮至基本無乙醇流出，過濾，得深黃色固體，為格爾德霉素浸提濃縮物。

1.3 聚合物納米微球?qū)游鰲l件的選擇

裝柱：取100 g聚合物納米微球用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，重力沉降法裝柱(2.5 cm×30 cm)，用40%乙醇平衡系統(tǒng)。

1.3.1 聚合物納米微球型號的篩選

分別用型號為PS30RPC、NM-MM100、PS/PVB300的聚合物納米微球裝柱，取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱，用120 mL 40%乙醇洗滌，然后用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，洗脫速度5 mL·min-1，收集洗脫液，每管10 mL。HPLC檢測分離效果，將格爾德霉素含量(面積歸一法，下同)大于98.5%的接收液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.3.2 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于PS30RPC聚合物納米微球柱上，用40%乙醇洗滌層析柱，然后用不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫，洗脫速度5 mL·min-1，通過中壓層析色譜檢測器在線監(jiān)測，觀察格爾德霉素主峰與雜質(zhì)峰的分離效果。

1.3.3 洗脫速度的選擇

取0.8 g格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于PS30RPC聚合物納米微球柱上，用120 mL 40%乙醇洗滌，用65%乙醇作為洗脫劑，分別采用4 mL·min-1、5 mL·min-1、6 mL·min-1、7 mL·min-1、8 mL·min-1的洗脫速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每管10 mL。HPLC檢測分離效果，將格爾德霉素含量大于98.5%的接收液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.3.4 加樣量的選擇

分別按照加樣量(格爾德霉素浸提濃縮物與聚合物納米微球質(zhì)量比，g∶g，下同)為1∶150、1∶125、1∶100、1∶75、1∶50加樣，用120 mL 40%乙醇洗滌層析柱，用65%乙醇洗脫，洗脫速度6 mL·min-1，收集洗脫液，每管10 mL。HPLC檢測分離效果，將格爾德霉素含量大于98.5%的接收液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.4 結(jié)晶

合并格爾德霉素含量大于98.5%的洗脫液，減壓濃縮至基本無乙醇，5 ℃放置2 h，過濾，用水洗滌濾餅，真空干燥，得到格爾德霉素粉末。

1.5 HPLC色譜條件

色譜柱：Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相為乙腈-水(70︰30)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長304 nm；進(jìn)樣量10 μL。

稱取格爾德霉素對照品10 mg用流動相溶解，配制成約25 μg· mL-1的溶液。取對照品溶液10 μL注入色譜儀，按上述色譜條件外標(biāo)法測定，以峰面積計(jì)算。該方法在格爾德霉素濃度為0.75～75 μg· mL-1時有良好線性關(guān)系(R=0.9999)；平均回收率(n=5) 為100.2%，RSD為0.37%。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物納米微球?qū)游鰲l件的確定

2.1.1 聚合物納米微球型號的確定(圖1)

圖1 不同型號聚合物納米微球的洗脫收率

從圖1可知，PS30RPC聚合物納米微球在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、70%時對格爾德霉素的分離效果均較好，因此，選擇PS30RPC聚合物納米微球作為層析填料。

2.1.2 洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定

通過中壓層析色譜檢測器在線監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)大于65%時，格爾德霉素洗脫過快，主峰與雜質(zhì)峰不能有效分離；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)小于65%時，色譜峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，且格爾德霉素洗脫速度大于雜質(zhì)擴(kuò)散速度，分離效果并沒有提高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，格爾德霉素分離效果好、洗脫速度快。因此，選擇洗脫液乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

2.1.3 洗脫速度的確定(圖2)

圖2 不同洗脫速度下的洗脫收率

從圖2可知，洗脫速度為6.0 mL·min-1時，洗脫收率最高，因此，選擇洗脫速度為6.0 mL·min-1。

2.1.4 加樣量的確定(圖3)

圖3 不同加樣量下的洗脫收率

從圖3可知，在保證分離度的前提下，隨著格爾德霉素加樣量的增加，格爾德霉素的洗脫收率逐漸下降，當(dāng)加樣量超過1∶100時，洗脫收率顯著下降，低于80%。片面地增加加樣量，會導(dǎo)致上樣過載，造成格爾德霉素與雜質(zhì)的重疊，使格爾德霉素的洗脫收率降低。綜合單批產(chǎn)量與產(chǎn)品回收率，選擇加樣量為1∶100。

2.2 工藝驗(yàn)證

確定聚合物納米微球分離純化格爾德霉素的工藝為：采用PS30RPC型聚合物納米微球作為層析填料，格爾德霉素浸提濃縮物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱，用120 mL 40%乙醇洗滌后，65%乙醇洗脫，洗脫速度6.0 mL·min-1，加樣量(樣品∶填料，g∶g)為1∶100。經(jīng)過5批中試放大，結(jié)果表明：PS30RPC型聚合物納米微球可以很好地對格爾德霉素發(fā)酵菌絲體浸提物進(jìn)行純化，平均層析收率為92.5%，總平均收率為81.6%，平均成品純度為98.7%。

3 結(jié)論

確定聚合物納米微球分離純化格爾德霉素工藝為：選擇PS30RPC型聚合物納米微球?yàn)閷游鎏盍?，將格爾德霉素發(fā)酵菌絲體浸提物用95%乙醇溶解后加樣于層析柱，用120 mL 40%乙醇洗滌，65%乙醇洗脫，洗脫速度6.0 mL·min-1，加樣量(樣品∶填料，g∶g)1∶100。此時，平均層析收率為92.5%、平均總收率為81.6%、平均成品純度為98.7%。該分離純化方法簡便可靠，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 廖志勇，甄永蘇.熱休克蛋白90抑制劑Geldanamycin的抗腫瘤作用研究進(jìn)展[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001，36(9)：716-720.

[2] Blagosklonny M V.Hsp-90-associated oncoproteins：Multiple targets of geldanamycin and its analogs[J].Leukemia，2002，16(4)：455-462.

[3] Chiosis G.Targeting chaperones in transformed systems—A focus on Hsp90 and cancer[J].Expert Opinion on Therapeutic Targets，2006，10(1)：37-50.

[4] Nowakowski G S，McCollum A K，Ames M M，et al.A phase I trial of 17-allylamino-17-demethoxy-geldanamycin in patients with advanced cancer[J].Clinical Cancer Research，2006，12(20)：6087-6093.

[5] 劉濤，屈凌波，李繼安，等.格爾德霉素分離純化工藝的研究[J].藥物生物技術(shù)，2010，17(3)：247-250.