薛文嬌，范代娣

(1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.西北大學(xué)化工學(xué)院 陜西省可降解生物醫(yī)藥材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程對(duì)于發(fā)酵過(guò)程雖是一個(gè)獨(dú)立的變量，卻是影響發(fā)酵過(guò)程效率和經(jīng)濟(jì)性的關(guān)鍵因素之一[1]。在小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵過(guò)程中觀測(cè)到的過(guò)程變化很多都是由于接入的種子條件有所變化造成的；在發(fā)酵放大過(guò)程中，合適的種子擴(kuò)大培養(yǎng)過(guò)程的建立對(duì)于放大培養(yǎng)也至關(guān)重要[2]。據(jù)報(bào)道，接入的種子年齡及種子密度都直接影響著滯后期的長(zhǎng)短、比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞得率、成孢子性及最終產(chǎn)品的質(zhì)量，從而影響生產(chǎn)成本[1]。

類人膠原蛋白(Human-like collagen，HLC)是利用基因工程技術(shù)將人體膠原蛋白的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)酶切修飾并進(jìn)行特定的序列重復(fù)后重組于E.coli內(nèi)，經(jīng)過(guò)高密度發(fā)酵生產(chǎn)出來(lái)的一種高分子生物蛋白，該蛋白不但維持了膠原蛋白的特性，并由于其獨(dú)特的重復(fù)結(jié)構(gòu)，賦予其新的特性，因此應(yīng)用領(lǐng)域更加廣闊[3]。在HLC的生產(chǎn)放大過(guò)程中，為了獲得足夠多的接種量，需要增加種子的培養(yǎng)階段。鑒于中試生產(chǎn)罐為500 L規(guī)模，作者在此采用50 L的種子罐進(jìn)行第三級(jí)種子培養(yǎng)，以中試規(guī)模的最終菌體濃度、目標(biāo)蛋白濃度及目標(biāo)蛋白產(chǎn)率為考核指標(biāo)，考察三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程中不同移種階段和不同種子培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，以確定最優(yōu)條件。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

基因工程菌E.coliBL21，卡那抗性，溫度誘導(dǎo)；質(zhì)粒pNWCP31，自行構(gòu)建并保存[4]。

種子培養(yǎng)基采用固體LB培養(yǎng)基和液體LB培養(yǎng)基，三級(jí)種子培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)確定，發(fā)酵培養(yǎng)基和補(bǔ)料培養(yǎng)基成分同文獻(xiàn)[4]。

1.2 方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)

從LB平板上刮取單菌落，置于盛有50 mL種子培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，于32 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)10 h；然后將一級(jí)種子轉(zhuǎn)接入盛有50 mL種子培養(yǎng)基的300 mL搖瓶中，在相同的條件下培養(yǎng)10 h。

1.2.2 三級(jí)種子培養(yǎng)

將已培養(yǎng)好的二級(jí)種子培養(yǎng)液接種到裝有24 L三級(jí)種子培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，控制溫度在32 ℃。在三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程中，通過(guò)調(diào)節(jié)空氣流量、提高攪拌轉(zhuǎn)速和罐壓以控制DO在20%空氣飽和度，用25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH值為6.8。

1.2.3 分批-補(bǔ)料培養(yǎng)

將已培養(yǎng)好的三級(jí)種子培養(yǎng)液接種到裝有240 L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 L發(fā)酵罐中，控制溫度為32 ℃、空氣進(jìn)氣流量為600 L·min-1。在分批-補(bǔ)料培養(yǎng)階段，通過(guò)提高攪拌轉(zhuǎn)速控制DO在20%空氣飽和度，用25%氨水自動(dòng)調(diào)節(jié)pH值為6.8。當(dāng)發(fā)酵罐中的葡萄糖耗盡時(shí)，采用近指數(shù)的補(bǔ)料方法控制比生長(zhǎng)速率[5]。當(dāng)OD600達(dá)到95(約45 g·L-1細(xì)胞干重)時(shí)，升溫至42 ℃開(kāi)始誘導(dǎo)，3 h后降溫至39 ℃，繼續(xù)誘導(dǎo)4～6 h。

1.2.4 移種階段的確定

分別在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期前期、中期、后期及穩(wěn)定期移種，考察中試規(guī)模菌體濃度、目標(biāo)蛋白濃度及目標(biāo)蛋白產(chǎn)率，以確定最佳移種階段。

1.2.5 三級(jí)種子培養(yǎng)基的確定

種子培養(yǎng)基的選擇是獲得合適的種子培養(yǎng)物的關(guān)鍵因素之一。Lincoln[6]認(rèn)為，選擇生產(chǎn)階段的發(fā)酵培養(yǎng)基作種子培養(yǎng)基可以縮短滯后期。而使用和發(fā)酵培養(yǎng)基完全不同的培養(yǎng)基作種子培養(yǎng)基是非常危險(xiǎn)的，因?yàn)閮煞N培養(yǎng)基的pH值、滲透壓以及陰離子差距過(guò)大可能會(huì)引起細(xì)胞吸收速率的突然改變，從而影響細(xì)胞的存活性[7]。因此，本實(shí)驗(yàn)除葡萄糖和酵母粉外，三級(jí)種子培養(yǎng)基中其它成分的濃度與發(fā)酵培養(yǎng)基相同。保持葡萄糖和酵母粉濃度比值不變，調(diào)節(jié)葡萄糖濃度分別為10 g·L-1、15 g·L-1、20 g·L-1、25 g·L-1、30 g·L-1、40 g·L-1，均在對(duì)數(shù)期后期移種，考察中試規(guī)模菌體濃度、目標(biāo)蛋白濃度及目標(biāo)蛋白產(chǎn)率，以確定最佳種子培養(yǎng)基。

1.2.6 分析方法

葡萄糖濃度：斐林試劑法[8]。

細(xì)胞密度：取10 mL發(fā)酵液，離心，棄上清液，將沉淀用重蒸水洗滌3遍后，60 ℃烘干至恒重。計(jì)算單位體積發(fā)酵液中細(xì)胞干重，即為細(xì)胞密度。

乙酸濃度：RP-HPLC法[9]。

類人膠原蛋白表達(dá)量：取10 mL發(fā)酵液，離心，棄上清液，將沉淀用重蒸水洗滌3遍后，重懸浮，超聲波破碎，用羥脯氨酸測(cè)定法[10]測(cè)量破碎上清液中類人膠原蛋白含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程特點(diǎn)

將搖瓶培養(yǎng)的二級(jí)種子(OD600達(dá)到2.4)接種到50 L種子罐進(jìn)行三級(jí)種子培養(yǎng)(培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20 g·L-1，其它成分同發(fā)酵培養(yǎng)基)，考察其培養(yǎng)過(guò)程特點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程的特征曲線

由圖1可以看出，該細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程符合一般分批培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)，即該過(guò)程基本由4個(gè)階段組成：滯后期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期與衰亡期(由于培養(yǎng)時(shí)間較短，衰亡期在圖中表現(xiàn)不明顯)。在對(duì)數(shù)期，細(xì)胞生長(zhǎng)最快，比生長(zhǎng)速率(μ)達(dá)到最大，約為0.7 h-1。在對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期之間還存在一個(gè)減速期。乙酸濃度在減速期就開(kāi)始下降，達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)其濃度已接近于0。由于減速期持續(xù)時(shí)間較短，同時(shí)其生理特征介于對(duì)數(shù)期和穩(wěn)定期之間，故在后續(xù)移種階段的考察中未考慮該階段。

2.2 移種階段的確定

根據(jù)三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程的特征曲線，分別在細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期前期(培養(yǎng)時(shí)間3 h)、中期(培養(yǎng)時(shí)間5 h)、后期(培養(yǎng)時(shí)間7 h)及穩(wěn)定期(培養(yǎng)時(shí)間10 h)移種，移種體積為發(fā)酵培養(yǎng)基初始體積的10%，考察移種階段對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，在對(duì)數(shù)期各階段移種，對(duì)最終的DCW及HLC濃度幾乎沒(méi)有影響，HLC表達(dá)量也相差不大，但是培養(yǎng)時(shí)間不等，并最終導(dǎo)致HLC平均產(chǎn)率不同。在對(duì)數(shù)期后期移種，HLC平均產(chǎn)率最高，達(dá)到0.518 g·L-1·h-1。這主要是因?yàn)樵趯?duì)數(shù)期后期移種，種子培養(yǎng)期達(dá)到的細(xì)胞密度最高，而種子活力及比生長(zhǎng)速率與對(duì)數(shù)期前期及中期基本相同，因此接入到生產(chǎn)罐時(shí)，達(dá)到同樣細(xì)胞密度所需的時(shí)間最短。

表1 移種階段對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

由表1還可知，在穩(wěn)定期移種，HLC表達(dá)量最高，而最終HLC濃度卻最低。這是因?yàn)?，最終DCW(52.4 g·L-1)相比對(duì)數(shù)期移種有很大程度的降低(約降低17%)。盡管有研究表明，相比對(duì)數(shù)期接種，穩(wěn)定期接種可提高質(zhì)粒穩(wěn)定性[11]。但本研究所使用的表達(dá)體系和發(fā)酵體系的質(zhì)粒穩(wěn)定性較好，因此穩(wěn)定期接種與對(duì)數(shù)期接種相比，其質(zhì)粒穩(wěn)定性的提高并不明顯，反而導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、滯后期延長(zhǎng)，最終DCW降低，進(jìn)而導(dǎo)致最終HLC濃度及平均產(chǎn)率降低。

2.3 種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度的確定

培養(yǎng)基濃度高，得到的種子密度高，發(fā)酵過(guò)程所需的時(shí)間較短，目標(biāo)蛋白產(chǎn)率就高；但培養(yǎng)基濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致乙酸等有害副產(chǎn)物濃度增加，影響移種細(xì)胞的生理狀態(tài)，從而影響發(fā)酵過(guò)程及目標(biāo)蛋白產(chǎn)率。此外，對(duì)于重組菌培養(yǎng)過(guò)程，其質(zhì)粒穩(wěn)定性對(duì)于目標(biāo)蛋白產(chǎn)率非常重要。培養(yǎng)基濃度過(guò)高，可能會(huì)延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而細(xì)胞在高速生長(zhǎng)時(shí)，其質(zhì)粒的丟失率也較高，因而會(huì)降低目標(biāo)蛋白表達(dá)量。在HLC生產(chǎn)過(guò)程中，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響見(jiàn)表2。

表2 種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響

由表2可知，當(dāng)種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度低于20 g·L-1時(shí)，所需的培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，導(dǎo)致HLC平均產(chǎn)率較低；當(dāng)種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度高于20 g·L-1時(shí)，由于質(zhì)粒丟失，最終HLC濃度降低，同時(shí)HLC表達(dá)量降低；特別是當(dāng)種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為40 g·L-1時(shí)，不僅最終HLC表達(dá)量降低，最終DCW也急劇降低，其原因可能是在該批次種子培養(yǎng)過(guò)程中，鑒于設(shè)備供氧能力，無(wú)法保持DO在20%空氣飽和度，從而可能導(dǎo)致混合酸發(fā)酵副產(chǎn)物，影響種子存活力。因此，在三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程中，其培養(yǎng)基中葡萄糖濃度宜選擇20 g·L-1，其后發(fā)酵過(guò)程所需的培養(yǎng)時(shí)間較短，HLC表達(dá)量較高，HLC平均產(chǎn)率最高達(dá)到0.518 g·L-1·h-1。

3 結(jié)論

研究了三級(jí)種子培養(yǎng)過(guò)程中不同移種階段及不同種子培養(yǎng)基對(duì)類人膠原蛋白發(fā)酵過(guò)程的影響。結(jié)果表明：在對(duì)數(shù)期后期移種，HLC平均產(chǎn)率最高；而穩(wěn)定期接種，卻導(dǎo)致細(xì)胞活性降低、滯后期延長(zhǎng)，最終DCW、最終HLC濃度及HLC平均產(chǎn)率都較低。另外，當(dāng)種子培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為20 g·L-1時(shí)，其后發(fā)酵過(guò)程所需的培養(yǎng)時(shí)間較短，HLC表達(dá)量較高，HLC平均產(chǎn)率最高，達(dá)到0.518 g·L-1·h-1。

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