杜登學(xué)，王姍姍，宮風(fēng)華，周 磊，張志鵬

(1.山東輕工業(yè)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250353；2.上海啟達(dá)化工科技有限公司，上海 201512)

癌癥的發(fā)病率近年來(lái)迅速增長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命健康，對(duì)癌癥的治療早已提上日程。癌癥治療藥物種類(lèi)繁多，近年來(lái)新興的蛋白酶抑制劑類(lèi)藥物以其藥效高、副作用小、協(xié)同作用好等優(yōu)點(diǎn)受到重視。進(jìn)入21世紀(jì)，蛋白酶抑制劑類(lèi)抗癌藥物的研究成為熱點(diǎn)，較受關(guān)注的有硼替佐米(Bortezomib，1)、MG-132(2)、NLVS(3)、Tyropeptin A(4)、NPI-0052(5)、Lactacystin(6)、Omuralide(7)[1]等(結(jié)構(gòu)如圖1所示)。其中對(duì)硼替佐米的研究尤其活躍。

圖1 蛋白酶抑制劑類(lèi)抗癌藥物的結(jié)構(gòu)

1 簡(jiǎn)介

蛋白酶體是一個(gè)廣泛分布于真核細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的高度保守的具有多種催化功能的蛋白酶復(fù)合物，尤其能催化水解連接有多聚泛素鏈的蛋白，是泛素—蛋白酶體(UPP)通路的主要組分。泛素-蛋白酶體類(lèi)藥是癌癥治療陣營(yíng)中的新星，大量研究證實(shí)了其藥效藥性，拓寬了癌癥治療的途徑。泛素-蛋白酶體調(diào)控著人體內(nèi)必需、非必需或廢棄的細(xì)胞蛋白的降解，該調(diào)控在許多癌癥細(xì)胞中往往調(diào)控紊亂[2]。

治療多發(fā)性骨髓瘤的二肽硼酸類(lèi)化合物硼替佐米，在2003年得到了FDA的批準(zhǔn)，率先在美國(guó)上市；2005年9月在我國(guó)上市，成為第一個(gè)上市的蛋白酶抑制劑類(lèi)藥物。隨后一系列具有蛋白酶抑制活性的合成小分子化合物或提取的天然化合物進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

2 結(jié)構(gòu)機(jī)理

泛素-蛋白酶體是人體內(nèi)降解蛋白質(zhì)的主要途徑(90%)，其形狀是由5個(gè)β-螺旋折疊形成一個(gè)中空并由一個(gè)α-螺旋填充的緊致球形[3]，它的結(jié)構(gòu)核心蛋白酶體(26S)是一個(gè)ATP依賴(lài)性蛋白水解酶復(fù)合體[4]。26S蛋白酶體主要由1個(gè)圓柱型的20S的催化中心和2個(gè)V型的19S的調(diào)節(jié)粒子組成。19S的調(diào)節(jié)粒子上有多個(gè)ATP酶活性位點(diǎn)，主要作用是識(shí)別已經(jīng)泛素化的蛋白質(zhì)，經(jīng)過(guò)加工后，再將其轉(zhuǎn)運(yùn)至20S催化中心，賦予20S以ATP依賴(lài)性[5]。20S的催化中心主要由3個(gè)復(fù)合體酶的催化部位組成，分別為：類(lèi)糜蛋白酶活性(ChTL)、類(lèi)胰蛋白酶活性(TL)、蛋白酶樣活性[6]。這些蛋白酶具有不同的活性，可以定向水解蛋白質(zhì)上的特定氨基酸，達(dá)到水解蛋白質(zhì)、釋放多肽的目的。一般情況下蛋白酶抑制劑只抑制3個(gè)酶活性部位中的一個(gè)或兩個(gè)來(lái)抑制蛋白質(zhì)的水解，如硼替佐米只抑制類(lèi)糜蛋白酶的活性[7]。

蛋白酶體的活性對(duì)細(xì)胞功能的維持非常重要。26S蛋白酶體對(duì)蛋白的降解依賴(lài)于對(duì)靶蛋白的泛素化和泛素化蛋白的識(shí)別，該過(guò)程由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素連接酶E3依次完成[8～10]。蛋白酶體抑制劑能通過(guò)抑制蛋白酶體活性干擾和影響細(xì)胞正常的功能，通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)含量對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。利用蛋白酶體抑制劑選擇性抑制某些活性位點(diǎn)，從而改變蛋白酶體的酶切位點(diǎn)已成為免疫、抗炎等領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

3 抗癌特性

泛素-蛋白酶體主要有3個(gè)作用：加工非活性的蛋白前體成活性蛋白、調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白平衡和識(shí)別除去異常蛋白[11，12]。作用于蛋白酶體的抑制劑的抗癌機(jī)理說(shuō)法不一，但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分裂增長(zhǎng)中發(fā)揮著極為重要的作用是肯定的。臨床研究表明，蛋白酶類(lèi)抑制劑能夠使細(xì)胞中的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)集中在細(xì)胞質(zhì)中，從而降低一些酶的活性，達(dá)到抑制惡性細(xì)胞分裂的目的[6]。有人指出因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中蛋白質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)周期短，癌細(xì)胞對(duì)蛋白酶抑制劑更敏感[13]；有人則認(rèn)為在腫瘤細(xì)胞中，抑制劑與蛋白酶的作用時(shí)間比正常細(xì)胞長(zhǎng)[14]，阻礙癌細(xì)胞增長(zhǎng)；還有人認(rèn)為抑制劑在癌細(xì)胞中的降解速度較慢，作用時(shí)間長(zhǎng)，從而達(dá)到治療癌癥的目的[6，15]；腫瘤抑制因子在正常細(xì)胞中低水平表達(dá)，能很快被蛋白酶體降解，抑制劑能抑制酶體活性、增加腫瘤抑制因子濃度[16]。通過(guò)蛋白酶體來(lái)抑制蛋白質(zhì)的降解是近年來(lái)癌癥治療的研究熱點(diǎn)，它擴(kuò)大了化學(xué)治療藥的靶向范圍。

4 蛋白酶類(lèi)抑制劑藥物

4.1 醛基肽類(lèi)

蛋白酶抑制劑的研究始于醛基肽類(lèi)化合物，最早研究的主要有鈣蛋白酶抑制劑Ⅰ(Ac-Leu-Leu-nLeu-al)和天然放射菌類(lèi)產(chǎn)物亮太素(Ac-Leu-Leu-Arg-al)、MG-132、CEP-1612、CVT-634等。醛基肽類(lèi)化合物一般具有強(qiáng)的缺電子羰基和弱的位阻，醛基與蘇氨酸殘基的-OH結(jié)合，形成一個(gè)半縮醛的結(jié)構(gòu)，可逆性地抑制蛋白酶復(fù)合體的活性[17]，但是醛基肽類(lèi)抑制劑能很快被氧化成酸而被運(yùn)出體外，天然化合物大多數(shù)作用強(qiáng)度較低、選擇性不好，合成的稍好一些，但也未得到廣泛的應(yīng)用。后來(lái)人們?yōu)榱嗽鰪?qiáng)其藥性做了一些改進(jìn)，比如在醛基的α位引入羰基、靶向載體[18]等，但總的來(lái)說(shuō)應(yīng)用不夠廣泛。

4.2 β-內(nèi)酯類(lèi)

β-內(nèi)酯類(lèi)化合物大多是從天然產(chǎn)物提取出來(lái)的。鏈霉菌代謝產(chǎn)物L(fēng)actacystin是從自然界分離出來(lái)的首個(gè)非肽類(lèi)高度特異的蛋白酶抑制劑，Lactacystin在體內(nèi)經(jīng)過(guò)Jurkat T酶催化形成β-內(nèi)酯活性中間體Omuralide(化合物7)[19]，受絲氨酸殘基上羥基的進(jìn)攻，打開(kāi)內(nèi)酯環(huán)不可逆地抑制蛋白酶體的活性，其中酰胺環(huán)上的取代基對(duì)抑癌效果有很大的影響。

4.3 非共價(jià)類(lèi)

一般的蛋白酶抑制劑都是以共價(jià)鍵同調(diào)節(jié)靶向結(jié)合，非共價(jià)抑制劑是同活性位點(diǎn)旁的特種基團(tuán)發(fā)生非共價(jià)作用，例如氫鍵、范德華力等。該類(lèi)化合物包括2-氨基芐基Staine結(jié)構(gòu)為母體的化合物和環(huán)肽類(lèi)化合物。TMC-95 A～D化合物是從菌屬Apiosporamontagnei中提取的經(jīng)過(guò)修飾的氨基酸殘基環(huán)肽類(lèi)化合物[20]，該類(lèi)化合物是天然提取產(chǎn)物中唯一的非共價(jià)抑制劑，藥效在納摩爾級(jí)。該類(lèi)物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，全合成有一定難度。

4.4 硼酸肽類(lèi)

硼酸肽類(lèi)化合物是現(xiàn)階段最重要的蛋白酶抑制劑。一些研究已明確表明它有較好的蛋白酶體抑制活性和選擇性，主要抑制核心蛋白酶體20S中類(lèi)糜蛋白酶的活性。第一個(gè)硼酸肽類(lèi)蛋白酶抑制劑藥物硼替佐米是由日本武田和美國(guó)強(qiáng)生公司共同研發(fā)的，用于治療復(fù)發(fā)和難治性多發(fā)性骨髓瘤[21]。

4.4.1 硼替佐米的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

硼替佐米是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中26S蛋白酶體糜蛋白酶樣活性的可逆抑制劑?；钚灾行氖腔衔镏械呐鹚峤Y(jié)構(gòu)，化合物中硼原子外層只有6個(gè)電子，含有一個(gè)空軌道，是一個(gè)典型的Lewis酸結(jié)構(gòu)，可以與蛋白酶體中催化中心的絲氨酸殘基中的-OH形成配位鍵，從而可逆性地抑制酶的活性。其結(jié)構(gòu)改造主要通過(guò)改造二肽硼酸主鏈上的3個(gè)殘基來(lái)進(jìn)行。近年來(lái)用此法也發(fā)現(xiàn)了一些有較高醫(yī)用性的藥物，有的已進(jìn)入臨床前試驗(yàn)[22]。

體外研究表明，硼替佐米對(duì)多種類(lèi)型的癌變細(xì)胞有細(xì)胞毒性。它在人體內(nèi)可以引起腫瘤細(xì)胞凋亡，并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性[23]。

多發(fā)性骨髓瘤被界定為不可治愈的疾病，臨床表現(xiàn)不盡相同，硼替佐米對(duì)表達(dá)細(xì)胞周期蛋白D1的患者有更好的療效。硼替佐米對(duì)多種腫瘤都有很好的治療效果，如淋巴腫瘤、白血病、乳腺癌等，已經(jīng)是抗癌領(lǐng)域的先鋒藥。對(duì)很多已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞有很好的抑制增殖作用。與其它抗癌藥物如帕替尼、地塞米松、阿霉素、沙利度胺、馬法蘭等聯(lián)合使用，具有療效疊加及協(xié)同效應(yīng)，還能延緩病變細(xì)胞的耐藥性。

4.4.2 硼替佐米的合成

硼替佐米化學(xué)名稱(chēng)[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羧基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸，屬于α-氨基硼酸肽類(lèi)化合物，此類(lèi)化合物的生物藥效明顯，但一般來(lái)說(shuō)合成比較困難，主要原因是硼酸的α位存在一個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，它是化合物活性的重要組成部分。α-氨基硼酸部分的合成，以前基本上都是采取Matteson′合成法[24]，由手性硼酸酯反應(yīng)得α-氯硼酸酯，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成α-氨基硼酸。

此外，Sadighi′在Backer的研究基礎(chǔ)[25]上設(shè)計(jì)了新的合成方法[26]：在金屬銅配合物的催化作用下，亞胺中間體8與化合物9加成，生成α-氨基硼酸化合物10，這一步驟的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高、穩(wěn)定性好、立體選擇性也較好。然后在酸性條件下，選擇性地水解氮端的磺?；鶊F(tuán)，得到化合物11?；衔?1在TBTU的催化下，與N-Boc-L-苯丙氨酸反應(yīng)，經(jīng)鹽酸酸化得到化合物12?；衔?2與(2-Pyrazine)COOH發(fā)生耦合反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)水解硼酸保護(hù)基團(tuán)后純化即得到物硼替佐米(即化合物1)。合成路線見(jiàn)圖2。

圖2 硼替佐米的Sadighi′合成路線

Zhu等[1]以蒎烯和L-苯丙氨酸為原料合成硼替佐米。先將蒎烯氧化(該步需使用劇毒催化劑四氧化鋨)，再以二氯甲烷為起始反應(yīng)物經(jīng)酯化、取代、構(gòu)型選擇等得到重要的活性中間體16，再由化合物16和氨基酸縮合物17經(jīng)縮合、硼酸化得目標(biāo)產(chǎn)物，純化后得到純的硼替佐米，具體合成路線見(jiàn)圖3。該合成路線比較長(zhǎng)，多步反應(yīng)需在較低溫條件下才能完成，不太適合工業(yè)化生產(chǎn)。

除此之外還有多類(lèi)抑制劑如乙烯基磺酰化合物、環(huán)氧酮類(lèi)[27，28]、多酚類(lèi)、β-內(nèi)酰胺[29]、偶氮肽類(lèi)等類(lèi)型的抑制劑。

5 展望

當(dāng)今雖然有很多種抗癌藥物，但或多或少都存在一些問(wèn)題，如藥效差或毒副作用大等。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白質(zhì)控制系統(tǒng)，泛素-蛋白酶體監(jiān)控體系參與細(xì)胞的整個(gè)增殖、分化和凋亡過(guò)程。異常的泛素-蛋白酶體行為與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系，這主要是由于異常的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)重要功能蛋白質(zhì)的降解失常所造成的。因此，研究靶向作用于蛋白酶體的藥物對(duì)于控制治療一些腫瘤疾病有重要的意義。上述的幾類(lèi)化合物中，有的已經(jīng)得到了很好的應(yīng)用，其中硼酸肽類(lèi)和β-內(nèi)酯類(lèi)化合物對(duì)靶點(diǎn)的選擇性好、副作用少，市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力較大。

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