靳 祎， 王恩軍， 郭曉軍， 袁洪水， 朱寶成

(1.河北大學基礎醫(yī)學院，河北保定071000;2.河北農業(yè)大學生命科學學院，河北保定071001)

蜘蛛毒素是由神經毒性肽、蛋白質和低分子量物質所構成的復雜混合物，具有多種活性［1-2］。雷氏大疣蛛Macrothele raveni是最近發(fā)現的一種異仿科大疣蛛屬蜘蛛新種［3］。有報道它可以抑制人肝癌BEL-7402、HepG2細胞和宮頸癌Hela細胞的增殖，主要是細胞周期相關基因c-myc表達減弱以及誘導p21基因的表達［4-6］。有關蜘蛛毒素抗腫瘤活性蛋白的分離純化方面的研究，國內尚未見報道。對此，本實驗采用反相層析法對雷氏大疣蛛毒素進行了分離純化，收集到13個組分，通過采用MTT法檢測各蛋白組分的抗腫瘤活性，發(fā)現具有抗腫瘤活性的組分4個，其中組分13的抑制作用較強，而且峰型較單一，適宜做進一步分離純化。本實驗就此組分對Hela細胞的抑制作用進行了研究，為雷氏大疣蛛毒素作為新型抗腫瘤藥物的深入研究及臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人宮頸癌細胞株Hela 由軍事醫(yī)學科學院提供。

1.1.2 試劑 雷氏大疣蛛毒素干粉購自廣西南寧南方蜘蛛養(yǎng)殖研究所;胎牛血清購自中國醫(yī)學科學院生物工程研究所;RPMI-1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自GIBCO公司;順鉑購自齊魯制藥有限公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、乙二胺四乙酸(EDTA)購自Sigma公司;考馬斯亮藍R-250染液購自北京賽馳生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Hela細胞的培養(yǎng) 接種宮頸癌Hela細胞于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中。細胞貼壁生長，0.25%胰蛋白酶消化，每周傳代2次，取對數生長期的細胞用于試驗。

1.2.2 雷氏大疣蛛毒素組分13的分離 將雷氏大疣蛛毒素粉末溶于雙蒸水，質量濃度為50 mg/mL，14000 r/min離心10 min，取上清液，0.45 μm 濾膜過濾。將樣品上樣于AKTA explorer 100型蛋白液相色譜儀，采用反相層析法進行分離純化，分步收集各個組分，將組分13置于超低溫冰箱中直至成固態(tài)后，再放置于冷凍干燥機中，抽真空濃縮，直至樣品完全干燥，置于-20℃冰箱保存。

1.2.3 MTT法檢測各分離組分的抗癌活性 取對數生長期的Hela細胞，胰酶消化后充分吹打混勻成單細胞懸液，用RPMI-1640培養(yǎng)基調整細胞數，制成2×104個/mL的細胞懸液，加入96孔板中，每孔加入200μL。細胞貼壁培養(yǎng)24 h。實驗分3組，空白對照組加生理鹽水，陽性對照組加順鉑(質量濃度為20μg/mL)，實驗組加入不同質量濃度(分別為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL)的毒素分離組分，每個劑量6個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，取出培養(yǎng)板每孔加入5 μg/μL的MTT液(RPMI1640培養(yǎng)基配制)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 4h，棄掉培養(yǎng)基，每孔加入 DMSO 150μL，震蕩15 min，充分溶解結晶顆粒，于酶標儀上測定各孔吸光度值(A值)，測定波長λ=570 nm，參考波長λ=630 nm，計算各分離組分對Hela細胞增殖的抑制率(Grow inhibitory rate，GIR)，并計算活性蛋白組分對Hela細胞半抑制率(IC50)。所有試驗均重復3次。

增殖細胞抑制率(%)=(1-實驗組A值 /空白對照組A值)×100%

1.2.4 形態(tài)學變化 待Hela細胞進入對數生長期以1×105/孔的密度接種于48孔細胞培養(yǎng)板內，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中24 h，實驗組加入含20 μg/mL組分13的RPMI-1640培養(yǎng)基，對照組加入含生理鹽水的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察細胞的形態(tài)學改變并攝片。

1.2.5 活性組分的SDS-PAGE電泳 采用SDS-PAGE檢測抗癌活性蛋白組分的純度和分子質量。分離膠濃度12%，pH8.8，濃縮膠濃度為 4%，pH 6.8，加速劑 N，N，N，N ˊ-四甲基乙二胺(TEMED)10μL，助凝劑10%過硫酸銨(APS)50μL，并且點上標準分子量蛋白。電泳結束后，取出凝膠并作標志，將凝膠放入染色盤中。加入考馬斯亮藍R-250染液染色，37℃保溫染色30 min。倒出染色液，用蒸餾水洗膠板數次后加入乙酸、乙醇混合溶液脫色。反復漂洗，直至背景清晰為止，檢測樣品的分子量及成分純度。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用The SAS system 6.12統(tǒng)計軟件進行數據分析。所有數據用均數±標準差表示。兩組間數據用t檢驗。

2 結果

2.1 組分13對Hela細胞抑制作用的量效和時效關系 不同濃度的雷氏大疣蛛毒素組分13作用于體外培養(yǎng)的Hela細胞48h后，MTT結果顯示組分13對Hela細胞具有顯著的抑制作用，實驗組與對照組比較，A值差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。其抑制率隨濃度的降低有所下降，在一定范圍內呈濃度依賴性，量效關系良好(見表1)。

表1 雷氏大疣蛛毒素組分13對Hela細胞增殖的抑制作用

Hela細胞經雷氏大疣蛛毒素組分13作用于24、48、72 h后，結果表明細胞一直處于被抑制狀態(tài)，且隨著作用時間的延長，抑制作用明顯增強，時效關系良好(見表2)。

表2 雷氏大疣蛛毒素組分13不同作用時間對Hela細胞的抑制率

2.2 組分13對Hela細胞的IC50通過MTT法作出的Hela細胞生長曲線可以得到雷氏大疣蛛毒素組分13抑制細胞生長50%時的質量濃度為24 μg/mL(48 h)。

2.3 組分13的SDS-PAGE電泳 見圖1。對組分13進行SDS-PAGE電泳分析，組分13顯示出兩個高分子量條帶，分子量在大約80KDa左右。

2.4 形態(tài)學觀察 正常宮頸癌Hela細胞生長良好，密度較大，部分重疊成簇，細胞為長梭形或多角形，隱約可見胞核圓形，位于中央，排列不規(guī)則，細胞界限清晰，培養(yǎng)液中僅見少許漂浮的細胞;Hela細胞經組分13處理后，細胞數量明顯減少，細胞逐漸變?yōu)閳A形，體積縮小，胞膜皺縮，細胞間連接消失，與周圍的細胞脫離，培養(yǎng)液中有許多漂浮的呈桑葚樣細胞，碎片較多。

圖1 雷氏大疣蛛毒素組分13的SDS-PAGE電泳圖譜

3討論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家排行榜首。中西醫(yī)綜合治療癌腫是我國腫瘤研究的成就，中醫(yī)中藥治癌副作用小，減輕患者放療、化療的毒副反應，提高生存質量，延長生命，降低癌癥的死亡率。因此新型抗癌藥物的研發(fā)倍受人們關注。

蜘蛛毒素在抗癌方面的研究已經證實對多種腫瘤細胞具有明顯的抑制作用［4-8］，因此在新型抗腫瘤藥物的研究方面顯示出廣闊的開發(fā)前景。本試驗使用人宮頸癌Hela細胞作為腫瘤細胞模型，采用反相層析法對雷氏大疣蛛毒素進行了初步分離，并檢測了各蛋白組分抗癌活性。其中組分13對Hela細胞呈現出較強的抗癌活性，顯示較好的量效關系和時效關系。另外，SDS-PAGE電泳表明組分13是由分子量在80KDa左右的蛋白組成，為下一步蛋白的繼續(xù)分離純化及新型抗腫瘤藥物的開發(fā)和研制奠定理論基礎。

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