陳玉萍，魏東寧，肖 漓

0 引 言

MG是乙酰膽堿受體抗體介導的自身免疫性疾病，細胞免疫和補體參與其發(fā)病機制。細胞免疫紊亂是MG發(fā)病的重要原因之一。正常情況下，機體外周血中CD4+/CD8+T細胞比值相對穩(wěn)定。當T細胞亞群的數(shù)量和功能異常時，機體免疫功能紊亂并導致一系列病理變化。研究已證實MG患者外周血T淋巴細胞亞群異常，表現(xiàn)為CD8+T細胞百分比下降，導致CD4+/CD8+比值升高［1］。胸腺切除術及激素治療 MG通過調整T淋巴細胞亞群異常，恢復正常T細胞免疫而發(fā)揮治療作用的［2］。因此 T淋巴細胞在 MG的發(fā)生、發(fā)展及治療過程中起重要作用。本文研究了112例不同年齡、性別、臨床分型MG患者外周血T淋巴細胞亞群分布特點，分析藥物和手術治療的MG的轉歸與T淋巴細胞亞群異常的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 112例MG患者為我院神經(jīng)內科重癥肌無力治療中心2008年1月至2010年1月的住院患者，均根據(jù)典型病史、臨床體征、新斯的明試驗、重復電刺激及胸部CT檢查而確診。其中男女性各56例，年齡3～77歲，平均(35.5±18.4)歲。病程0.5月～21年，其中1年以下70例，1年以上42例。按Osserman臨床分型，Ⅰ型(單純眼肌型)40 例(35.7%);Ⅱ型(全身型)69 例(61.6%)，其中ⅡA(輕度全身型)20例，ⅡB(中度全身型)49例;Ⅲ型(急性重癥型)3例(3.7%)。所有患者采血前6個月內未使用免疫抑制劑。健康人對照組為我院體檢者，共50例，年齡5～80歲，平均(37.2±19.4)歲。年齡、性別與MG組比較無統(tǒng)計學差異。

1.2 治療情況 112例MG患者中單用溴吡斯的明片治療者50例，溴吡斯的明片+醋酸潑尼松片者22例，接受擴大胸腺切除者40例。

1.3 外周血T、B淋巴細胞測定 用流式細胞儀(FACSCalibur)進行外周血B淋巴細胞亞群的測定。所有MG患者入院第2天抽血檢測T、B淋巴細胞水平。采用Follicol法制備外周血單核細胞懸液。PBS重懸細胞后分裝，每管100μl。然后分別加入FITC-CD3、PE-CD8、Percp-CD45、APC-CD4 熒光標記的單克隆抗體各10μl，另以未加抗體者作為陰性對照、熒光標記的同型抗體作為同型對照。室溫避光孵育20 min，用紅細胞裂解液裂解紅細胞10 min，1500 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，2 ml PBS洗滌1次，重新懸浮細胞至200μl，上流式細胞儀檢測。流式細胞儀為FACSCalibur，應用Cell Quest軟件進行細胞計數(shù)和結果分析。

1.4 隨訪及療效評定 112例患者治療后接受門診、電話進行療效的隨訪，觀察治療后服藥情況及癥狀的變化。隨訪時間為3～14個月，平均9個月。療效評定依照Monden標準［3］。A:癥狀緩解，不用藥物、無癥狀或遺留輕微癥狀，能勝任日常工作和生活);B:改善，降低藥物劑量或臨床癥狀減輕;C:無變化，臨床癥狀無改變;D:惡化，藥物用量增加或癥狀加重，包括死亡。A和B為治療有效預后良好，C和D為預后不良。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，結果用均數(shù)±標準差(±s)表示，定量資料兩組間比較采用獨立樣本t檢驗;多組間比較采用單因素多水平方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 MG患者外周血T淋巴細胞亞群的分布特點

2.1.1 比較MG患者組與正常對照組外周T淋巴細胞亞群分布特點 與健康人對照組相比，MG患者外周血CD8+T細胞百分比明顯降低(P＜0.01)，CD4+/CD8+比值異常升高(P ＜0.05)，而 CD4+T細胞百分比在2組間無差異，見表1。提示MG患者體內存在T淋巴細胞亞群分布異常。

表1 MG患者組與正常對照組外周CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 1 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients and controls(s)

表1 MG患者組與正常對照組外周CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 1 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients and controls(s)

組 別 n CD4+(%) CD8+(%) CD4+/CD8+50 39.92 ±8.07 26.01 ±5.34 1.54 ±0.52 MG 患者組 112 41.29 ±6.69 22.54 ±4.51 1.92 ±0.56 t－0.89 4.65 －3.09 P健康人對照組0.38 0.000 0.002

2.1.2 不同年齡、性別、臨床分型MG患者外周T淋巴細胞亞群分布特點的比較 不同性別和臨床分型MG患者外周血T細胞亞群分布無明顯差異。但隨年齡增加，MG患者體內CD4+/CD8+比值升高，不同年齡組外周血CD4+T細胞百分比差異顯著，見表2。提示MG患者體內T淋巴細胞亞群分布異常隨年齡而逐漸明顯。

表2 不同年齡、臨床分型MG患者組外周CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 2 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients of different age and clinical stages(s)

表2 不同年齡、臨床分型MG患者組外周CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群百分比及CD4+/CD8+比值Table 2 Distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and the ratio of CD4+/CD8+in the peripheral blood of MG patients of different age and clinical stages(s)

組 別 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+≤14 25 38.36 ±5.70 23.32 ±4.18 1.69 ±0.35年齡(歲) 15 ～49 64 42.22 ±6.27 22.94 ±4.29 1.92 ±0.52≥50 23 41.43 ±7.56 20.57 ±5.09 2.15 ±0.74 F 3.29 2.92 4.33 P 0.04 0.06 0.02臨床分型 Ⅰ 40 39.98±5.70 22.10±4.85 1.91±0.56ⅡA 20 40.00 ±6.44 21.65 ±4.42 1.96 ±0.63ⅡB 49 42.53 ±7.23 23.16 ±4.20 1.90 ±0.55Ⅲ 3 42.00 ±7.90 24.00 ±6.20 2.00 ±0.20 F 2.12 0.80 0.07 P 0.10 0.50 0.98

2.2 T淋巴細胞亞群異常與藥物和手術治療療效的關系 在除外年齡、性別、臨床分型及治療措施對預后影響的基礎上，分析患者治療前外周血T淋巴細胞亞群與經(jīng)膽堿酯酶抑制劑、糖皮質激素及胸腺擴大切除術后預后的關系。從表3可見，僅服用膽堿酯酶抑制劑患者預后與治療前外周血T細胞亞群百分比無關。而激素組和手術組預后良好者外周血CD8+T細胞百分比明顯低于預后不良者(P＜0.01)、CD4+/CD8+比值明顯高于預后不良者(P＜0.05)，提示術前外周血T淋巴細胞亞群異?？赡苡绊懱瞧べ|激素及胸腺擴大切除術預后。

表3 用藥物或手術治療不同預后的MG患者外周T淋巴細胞亞群百分比(s)Table 3 Correlation between the distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and prognosis of MG after medication or thymectomy(s)

表3 用藥物或手術治療不同預后的MG患者外周T淋巴細胞亞群百分比(s)Table 3 Correlation between the distribution of CD4+and CD8+T cell subsets and prognosis of MG after medication or thymectomy(s)

組 別 預后 n CD4+(%) CD8+(%)CD4+/CD8+A+B 30 38.84 ±7.25 24.35 ±6.62 1.75 ±0.70 C+D 20 40.65 ±7.84 24.85 ±6.64 1.75 ±0.57 t 0.77 0.07 0.00 P 0.39 0.79 1.00激素組 A+B 15 40.00 ±7.94 26.32 ±5.33 1.63 ±0.65 C+D 7 36.38 ±6.32 33.50 ±7.58 1.12 ±0.27 t 1.31 7.95 4.45 P 0.26 0.01 0.05手術組 A+B 30 39.40 ±7.36 26.10 ±6.66 1.60 ±0.57 C+D 10 38.04 ±8.95 30.74 ±9.02 1.32 ±0.62 t 0.60 7.70 5.50 P溴吡斯的明組0.44 0.01 0.02

3 討 論

MG是以乙酰膽堿受體抗體為主要抗體的自身免疫性疾病，雖然致病性免疫球蛋白是由B細胞分泌的，但其發(fā)病過程依賴調節(jié)性T細胞及其細胞因子的參與。臨床針對B細胞的一系列治療策略并未取得進展［4］。大量的研究側重于T細胞，尤其是調節(jié)性T細胞及其細胞因子［5－6］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調整MG患者細胞免疫紊亂，其臨床癥狀可得到明顯改善［7］。因此針對T細胞的免疫學研究是目前重癥肌無力研究的熱點［8］。

正常機體的調節(jié)性T淋巴細胞可分為輔助性和抑制性亞群，其中CD8+為抑制性T細胞，CD4+為輔助性T細胞。兩者互相制約，維持機體的免疫平衡，已有報道，T淋巴細胞亞群失衡與自身免疫性的疾病(如原發(fā)性干燥綜合征)的關系［9］。本研究表明MG患者體內存在T淋巴細胞亞群分布異常，其異常主要為CD8+數(shù)量的減少，CD4+/CD8+比值異常升高，而CD4+百分比無明顯變化。這與李作孝等［1］報道的結果一致。雖然CD4+T細胞在MG中的作用近來也受到廣泛關注［5，10－11］，并證實 MG患者胸腺中存在表達有Vβ5.1受體鏈的CD4+T細胞，能直接識別并作用于B細胞，產生乙酰膽堿受體抗體。但進一步的研究發(fā)現(xiàn)胸腺中表達Vβ5.1 CD4+T細胞的MG患者的外周血中Vβ5.1 CD4+T細胞數(shù)量并無增加［11］，提示 CD4+T細胞參與 MG的發(fā)生與其數(shù)量無關，主要是由于其其功能的改變。本研究也發(fā)現(xiàn)MG患者外周血CD4+T細胞百分比與健康人對照組相比無明顯差異，其功能是否有改變尚有待進一步確定。CD8+T細胞為抑制性T細胞，其如何參與MG的發(fā)生目前尚存在爭議。一部分研究者認為CD8+T細胞主要發(fā)揮調節(jié)作用，而在實驗獲得性MG的研究模型上證實其也參與MG形成的病理過程［12］。本研究發(fā)現(xiàn)MG患者體內CD8+抑制性T細胞數(shù)量的減少，使其抑制功能下降。雖然CD4+輔助性T細胞數(shù)量無明顯變化，但可能CD4+T輔助細胞功能亢進，促進B細胞異常增殖，產生針對自身抗原乙酰膽堿的自身抗體，從而誘發(fā)MG的發(fā)生。

進一步分析發(fā)現(xiàn)隨MG患者年齡的增加其T淋巴細胞亞群異常逐漸明顯，而與性別、臨床分型無關。一方面隨著年齡的增加，機體細胞免疫功能下降。劉學員等［13］研究發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，老年人外周血CD4+/CD8+比值升高，與本文的結果一致。另一方面MG患者胸腺瘤的發(fā)生率隨年齡的增加而增高，而胸腺瘤合并MG患者胸腺組織本身內成熟的CD8+T細胞減少，存在T淋巴細胞亞群的異常［14］，使得外周血中細胞免疫紊亂更加明顯。以上兩方面因素導致老年MG患者中T淋巴細胞亞群異常更為明顯。本文結果還表明T淋巴細胞亞群異常與臨床分型無關，這與文獻報道不盡一致，有報道［2，6］認為MG患者病情加重時，CD8+百分比下降，CD4+/CD8+比值升高;而病情緩解時CD8+百分比升高，CD4+/CD8+比值下降。不同臨床分型的MG患者病情嚴重程度與T細胞亞群數(shù)量異常的嚴重程度并不平行，可能更決定于T細胞亞群功能異常。研究也證實眼肌型和全身型MG患者外周血CD4+T細胞對乙酰膽堿受體的反應不同，提示不同臨床類型MG患者體內CD4+T細胞功能存在差異［15］。

此外本研究結果表明治療前患者T細胞亞群紊亂明顯者，即CD8+百分比下降、CD4+/CD8+比值升高明顯者，經(jīng)糖皮質激素及胸腺擴大切除術療效較好。此結果間接證實糖皮質激素及胸腺擴大切除術通過調整細胞免疫功能紊亂而發(fā)揮治療MG作用。這與文獻報道激素或胸腺手術治療后MG患者外周血CD4+、CD8+T細胞百分比及CD4+/CD8+比值恢復正常［16］，以及胸腺切除術后甲狀腺功能紊亂得到糾正相一致［17］。另一方面，此結果也提示治療前T細胞亞群紊亂明顯的患者，其細胞免疫紊亂在MG發(fā)病中占主導作用，細胞免疫紊亂逐漸得到糾正后，其臨床癥狀明顯改善。因此檢測外周血T淋巴細胞亞群百分比對于指導臨床治療、判斷預后有重要意義。

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