焦 鈺,胡瑜珩,牛

(西北農(nóng)林科技大學林學院,陜西楊凌 712100)

目前馬鈴薯生產(chǎn)上多利用塊莖進行種植,每一新品種如“黑美人”推廣后,隨著種植年限的增加,病毒也隨種薯無性世代繁殖的增加而在塊莖中積累,導致產(chǎn)量逐年下降,品種的優(yōu)良特性不斷喪失、生產(chǎn)潛力和商品價值受到嚴重影響。

“黑美人”富含花青素,硒等具抗癌,美容,防止高血壓之功效,營養(yǎng)價值高,但由于病毒病的危害,加之自然條件限制,在栽培過程中優(yōu)良品質(zhì)退化,造成嚴重的經(jīng)濟損失。對其進行脫毒培養(yǎng)具有很強的針對性和現(xiàn)實意義,可以有效防治病害。

脫毒種薯后代植株葉片的葉綠素含量提高,光合強度、光飽和點也顯著提高,呼吸強度明顯降低;葉片活性強,綠葉功能期延長,可較長時間為塊莖制造營養(yǎng)物質(zhì);水分代謝協(xié)調(diào),抗高溫抗干旱能力增強;吸收氮、磷、鉀能力增強,塊莖中淀粉磷酸化酶活性強,促進了淀粉合成和干物質(zhì)積累,營養(yǎng)物質(zhì)含量高經(jīng)濟效益好。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯“黑美人”、新大品、土豆-10、隴薯3號四個品種。

1.2 試驗設(shè)計

其主要設(shè)計步驟即脫毒瓶苗生產(chǎn)流程為[1]:品種選擇-脫毒處理-病毒檢測-脫毒瓶苗擴繁-培養(yǎng)-移栽。

1.3 試驗方法

馬鈴薯脫毒培養(yǎng),其核心技術(shù)是莖尖組織脫毒培養(yǎng)(又叫分生組織脫毒培養(yǎng))技術(shù),創(chuàng)新的用塊莖具芽眼部分進行脫毒培養(yǎng)。在超凈無菌操作條件下,運用人工配置的培養(yǎng)基經(jīng)過莖尖組織和芽眼脫毒培養(yǎng)脫去主要危害馬鈴薯的病毒病及真菌、細菌性病害,培育出不帶病菌的植株,并進行營養(yǎng)繁殖,快速繁育,將莖尖,芽眼脫毒苗進行病毒檢測,淘汰仍帶有病毒的幼苗,生產(chǎn)出無病毒的種苗應基金運于大田生產(chǎn)。

1.3.1 品種選擇 選擇馬鈴薯“黑美人”、新大品、土豆-10、隴薯3號四個品種作為實驗材料。

1.3.2 播種、剪芽及獲取芽眼 采用室內(nèi)播種法,即將馬鈴薯栽植在花盆內(nèi)使其發(fā)芽,待芽長至4～5 cm長時,剪取長為1～2 cm的壯芽進行實驗。芽眼獲取即將塊莖上具芽眼的部分切成小塊進行實驗。

1.3.3 外植體消毒 剪下幼芽,置于自來水下沖洗1～2 h,用75%酒精沖洗30 s,無菌水沖洗3～5次,在超凈臺上用0.1%HgCl分別浸泡6,8,10,12min,期間不斷攪動,使其消毒更徹底。最后用無菌水沖洗3～5次,用濾紙吸干水分,將其具生長點的位置切成小段,接于MS+6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。芽眼處理同莖尖,消毒時間為8min。

1.3.4 莖尖芽眼培養(yǎng) 在光照度1 000～3 000 Lx,每天光照16 h,溫度22～26℃條件下培養(yǎng)1個月左右。

1.3.5 轉(zhuǎn)接 將幼苗從培養(yǎng)瓶中取出并用無菌水沖洗3～5次,將其切成小段轉(zhuǎn)接到MS+6-BA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基上,并置于溫室中培養(yǎng)。

1.3.6 馴化(練苗)及移栽 移植前對其進行光、溫鍛煉,白天溫度23～27℃,晚上不低于14℃。將轉(zhuǎn)接的生長健壯,并長有3～4片子葉,高2～3 cm的小苗打開培養(yǎng)瓶蓋,置于溫室培養(yǎng)6～7 d即練苗,一定注意空氣濕度要高。然后將其移栽到育苗盤置于溫室中培養(yǎng),每隔2 h噴1次水,保證其生長所需溫度、光照、濕度等,觀察其生長狀況。

2 試驗結(jié)果分析

2.1 不同消毒時間對“黑美人”生長狀況的影響

制定消毒時間梯度,觀察實驗結(jié)果最后得出最佳消毒時間。在相同接種環(huán)境下接種并對其培養(yǎng),統(tǒng)計接種材料的生長狀況如表1。(每次每個時間接種12瓶,每次共48瓶)

表1 消毒時間與成活觀察

由表1可以看出消毒時間8 min時污染最少,生長較好,其消毒效果最好。10 min次之,6 min時間過短消毒不徹底,12 m in莖尖培養(yǎng)部分無污染未生長,因為時間過長莖尖組織幼嫩容易被殺死,失去生活力。

通過3次試驗根據(jù)不同消毒時間對“黑美人”生長狀況的影響,統(tǒng)計污染情況可得,莖尖培養(yǎng)污染占總接種數(shù)的40.9%,芽眼培養(yǎng)污染占總接種數(shù)的35.4%。芽眼培養(yǎng)較莖尖培養(yǎng)污染小。

2.1.1 污染分析 實驗污染較嚴重,在馬鈴薯莖尖,芽眼培養(yǎng)及快速擴繁過程中 ,經(jīng)常有部分接種苗瓶被污染 ,其主要途徑有3個方面。

(1)苗源及苗源瓶帶菌[2]。苗源瓶中的苗源已被污染,但由于是初期污染,菌源太小,肉眼不易發(fā)現(xiàn),接種到培養(yǎng)基瓶中引發(fā)多瓶感菌;苗源瓶表面消毒不徹底,常常粘有真菌、細菌、霉菌及一些雜菌,在接種過程中帶入接種瓶內(nèi)引起污染。

(2)培養(yǎng)基帶菌。經(jīng)過濕熱滅菌的培養(yǎng)基內(nèi)有時還存在未殺死的耐高溫的雜菌或因滅菌時間短、壓力不夠而造成培養(yǎng)基高壓滅菌不徹底。

(3)操作環(huán)節(jié)及氣流帶菌。在接種時,操作人員的身體和操作器械帶菌,傳播了接種室和組培室內(nèi)空氣中的雜菌,從而引起脫毒苗及培養(yǎng)基再度被污染,形成氣流傳菌污染。

2.1.2 污染來源及主要菌類 馬鈴薯脫毒培養(yǎng)中常造成污染的病原菌主要分為真菌類和細菌類。

(1)真菌污染。真菌污染出現(xiàn)較快 ,一般接種后的2～3 d就會發(fā)現(xiàn)菌絲 ,繼而很快地出現(xiàn)黑、白、黃、綠孢子。真菌污染一般是由空氣污染和瓶口邊的灰塵和真菌孢子落入器皿造成的,應嚴格進行無菌操作。

(2)細菌污染。細菌污染是指在培養(yǎng)過程中,在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀物體、菌落或渾濁的水跡狀,有時甚至出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀。細菌性污染主要是操作時使用了未經(jīng)消毒的工具,如鑷子、剪刀、容器等,或是由于呼吸排出的細菌。因此 ,對器械、器皿和未接種的培養(yǎng)基徹底消除污染菌源很關(guān)鍵 。把需要滅菌的器械、器皿用紙包好,與培養(yǎng)基一起放入高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌 ,滅菌時間不能超過 30 m in,以免引起培養(yǎng)基成分變化。

2.2 對馬鈴薯不同品種采用芽眼進行脫毒培養(yǎng)

通過測其株高,莖粗,觀察子葉顏色,統(tǒng)計子葉數(shù)對比其在相同培養(yǎng)條件下的生長狀況。統(tǒng)計不同品種馬鈴薯脫毒培養(yǎng)生長狀況如表2。

表2 不同品種生長狀況觀察

由以上統(tǒng)計可以看出“黑美人”較其他幾種生長勢弱,生長較慢。培養(yǎng)過程中對各種生長條件如溫度、濕度、光照等要求更嚴格,通過芽眼脫毒培養(yǎng)其生長快、整齊、健壯、生根快,根系發(fā)達。

3 結(jié)論

(1)脫毒培養(yǎng)中一般消毒時間為12 min,接種后污染較少,但多數(shù)不生長,因為升汞具很強的毒性滲入幼嫩的莖尖組織細胞,使莖尖組織失去生長活性。實驗中制定消毒時間梯度,通過統(tǒng)計接種后種苗的生長狀況得出最佳消毒時間為8 min。

(2)莖尖脫毒培養(yǎng)過程中要形成愈傷組織,長芽速度較慢,且生長較弱。創(chuàng)新的用馬鈴薯塊莖上具芽眼的部分消毒處理后進行脫毒培養(yǎng),既提高了生長速度,縮短了生長時間,又提高了無毒苗的生長勢,且污染較少。

(3)通過脫毒培養(yǎng),能有效解決“黑美人”因病毒侵染導致的品種退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)下降等問題;能保持優(yōu)良品種的特性,使其得到迅速應用;能快速繁殖,增產(chǎn)潛力大,實現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn),帶來巨大的經(jīng)濟效益。

致謝:衷心的感謝畢春俠老師,彭少兵老師對本次實驗的指導!

[1] 方子山,張國志.馬鈴薯脫毒苗快繁技術(shù)的改進與應用[J].農(nóng)家之友·現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究,2009(14):1-3.

[2] 高華援,王楠,王慶峰,等.馬鈴薯組織培養(yǎng)中常見的污染問題及解決辦法[J].吉林農(nóng)業(yè)科學,2007,32(2):28-30.