李秀山 孫國柱 高曉偉 楊雷方 王目綱 劉性強(qiáng) 韓仰軍

(河北省館陶縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科,河北 館陶 057750)

脊髓空洞前狀態(tài)是脊髓空洞癥形成的最初始病理變化,業(yè)已證實(shí)是脊髓空洞防治的最佳時(shí)間窗〔1〕。有證據(jù)表明,在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和急慢性損傷中可見到凋亡發(fā)生〔2,3〕,本課題組前期研究也證實(shí)脊髓空洞前狀態(tài)中存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔4〕。近年來,文獻(xiàn)報(bào)道在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起重要作用的蛋白激酶C(PKC)參與了神經(jīng)元的缺血性損傷,特別是神經(jīng)元凋亡〔5〕。但脊髓空洞前狀態(tài)PKC的激活在神經(jīng)細(xì)胞凋亡中所起的作用未見報(bào)道,為此,本研究通過測(cè)定動(dòng)物模型上頸髓神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)與胞膜 PKC的活性變化及Bcl-2、Bax表達(dá)變化,探討PKC激活參與脊髓空洞前狀態(tài)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康、體重1.5～2.0 kg的新西蘭白兔56只由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,隨機(jī)分為三組,其中高嶺土(Kaolin)組40只,生理鹽水組和假手術(shù)組各8只。Kaolin(分析純)購于上海試劑四廠。Pep Tag非放射性PKC活性檢測(cè)試劑盒購于美國Promega公司。鼠抗Bcl-2單克隆抗體、鼠抗Bax單克隆抗體,均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2 模型制作 應(yīng)用氯胺酮(30 mg/kg)耳緣靜脈麻醉,按文獻(xiàn)方法制作動(dòng)物模型〔6〕;生理鹽水組動(dòng)物枕大池僅注入37℃生理鹽水0.6 ml;假手術(shù)組動(dòng)物僅行枕大池假穿刺以作對(duì)照。術(shù)后分籠飼養(yǎng),自由進(jìn)水,連續(xù)7 d肌肉注射抗生素預(yù)防感染,必要時(shí)予以營養(yǎng)支持。模型成功的標(biāo)志:枕大池穿刺抽出無色、透明腦脊液,Kaolin順利注入枕大池且動(dòng)物出現(xiàn)一過性四肢癱。

1.3 術(shù)后神經(jīng)功能判定 術(shù)后每日應(yīng)用改良的Tarlov評(píng)分法對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分,標(biāo)準(zhǔn)如下:0分:無自主活動(dòng);1分:僅限于髖膝關(guān)節(jié)的非反射性運(yùn)動(dòng);2分:髖膝踝3個(gè)主要關(guān)節(jié)的活動(dòng);3分:能主動(dòng)支持體重和不協(xié)調(diào)步態(tài),或偶爾出現(xiàn)協(xié)調(diào)步態(tài);4分:前后肢協(xié)調(diào)步態(tài),行走時(shí)有趾間關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng);5分:正常步態(tài)。

1.4 標(biāo)本的制作和采集 對(duì)照組(生理鹽水組和假手術(shù)組)在術(shù)后,Kaolin組動(dòng)物分別在術(shù)后第1,3,7,14,21天各組隨機(jī)選取8只,在氯胺酮過度麻醉下斷頭處死,取出上頸髓,其中10 mm頸髓在-70℃低溫保存?zhèn)銹KC活性測(cè)定之用;剩余置入40 g/L多聚甲醛固定液中后固定24 h,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、4μm切片,用于組織學(xué)觀察和免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.5 底物磷酸化法測(cè)定脊髓PKC活性

1.5.1 胞膜/質(zhì)蛋白提取 各實(shí)驗(yàn)操作均在4℃以下進(jìn)行。切取100 mg標(biāo)本,勻漿粉碎,100 000 g離心1 h,上清液為胞漿蛋白,移至另一管中;沉淀部分加入胞膜蛋白提取液,超聲波助溶、過夜,100 000 g離心1 h,上清即為胞膜蛋白。

1.5.2 PKC活性測(cè)定 采用美國Promega公司的 Pep Tag非放射性PKC活性檢測(cè)試劑盒。按說明書將提取的膜性和胞漿PKC蛋白分別與PepTag C1肽、PKC激活溶液共同孵育30 min,上樣于0.8%瓊脂糖凝膠,恒壓(100 V)電泳約20 min,即有磷酸化部分的分離條帶明顯出現(xiàn),用刀片快速從陰極取下包括磷酸化部分的條帶(體積約250μl),加熱融化。在凝膠溶解液中搖勻,置于570 nm波長下,讀取吸光度,并按說明書計(jì)算PKC活性,用 pmol·min-1·mg protein-1表示。

1.6 Bcl-2和Bax免疫組化染色 采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組織化學(xué)染色試劑盒進(jìn)行染色。采用HPIAS-1000彩色病理圖文分析系統(tǒng),每張切片任取5個(gè)視野,高倍鏡下記數(shù)總細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算陽性細(xì)胞百分比。

1.7 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按試劑盒說明書操作。高倍視野(×400)下計(jì)算凋亡指數(shù)(AI),即每張片選取5個(gè)陽性細(xì)胞數(shù)最多的高倍視野,計(jì)算出平均陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件,各組數(shù)據(jù)以x ±s表示,采用單因素方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)后動(dòng)物神經(jīng)功能改變 Kaolin組動(dòng)物除術(shù)后出現(xiàn)一過性四肢癱外,于術(shù)后第3天出現(xiàn)進(jìn)食減少、精神萎靡;第7天出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙,包括反應(yīng)遲鈍、四肢無力、行走不穩(wěn),甚至癱瘓,并隨時(shí)間的延長而逐漸加重,甚至有的動(dòng)物出現(xiàn)脊柱側(cè)彎。與生理鹽水組和假手術(shù)組比較差異顯著 (P＜0.05)。見表1。

2.2 光鏡觀察結(jié)果 Kaolin組動(dòng)物于術(shù)后第3天神經(jīng)細(xì)胞特別是神經(jīng)元輕度腫脹。第7天細(xì)胞周圍間隙明顯較前增大,神經(jīng)元水腫加重,核膜、核仁稍顯模糊,管周組織略顯疏松(圖1A),Kaolin性肉芽腫與脊髓粘連較輕。第14天細(xì)胞周圍間隙較前進(jìn)一步增大,核膜、核仁模糊甚至消失,神經(jīng)元胞體內(nèi)尼氏體減少或消失 (圖1B),中央管飽滿,室管膜細(xì)胞受壓變平,管周組織疏松,呈明顯水腫改變;蛛網(wǎng)膜下腔可見Kaolin沉積,大量炎性細(xì)胞浸潤。第21天脊髓組織結(jié)構(gòu)明顯紊亂,水腫稍顯減輕,胞質(zhì)出現(xiàn)空泡,前角神經(jīng)元數(shù)量減少,膠質(zhì)細(xì)胞增生 (圖1C),中央管張力增加,室管膜上皮斷裂、脫落,Kaolin性肉芽腫形成。生理鹽水組和假手術(shù)組動(dòng)物脊髓神經(jīng)元輪廓正常,核及核仁清楚,胞質(zhì)內(nèi)尼氏體分布均勻,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞正常。

2.3 脊髓空洞前狀態(tài)中細(xì)胞凋亡情況和Bcl-2、Bax表達(dá)變化Kaolin組動(dòng)物術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)元均有凋亡發(fā)生。典型的凋亡細(xì)胞表現(xiàn)為染色質(zhì)凝集、邊集化,聚集于核膜下 (圖2A)。Bcl-2、Bax陽性細(xì)胞為細(xì)胞內(nèi)有棕黃色粗顆?；蜃攸S色細(xì)膩顆粒彌漫分布 (圖2B、2C)。神經(jīng)元凋亡于術(shù)后第1天增加,7～14 d達(dá)高峰,以后逐漸降低,21 d仍可見到凋亡發(fā)生。Bax陽性表達(dá)趨勢(shì)與神經(jīng)元凋亡基本一致,且Bax陽性表達(dá)明顯強(qiáng)于Bcl-2。正常對(duì)照組和假手術(shù)組僅見少量凋亡的少突膠質(zhì)細(xì)胞,Bcl-2、Bax亦僅有少量弱陽性反應(yīng)細(xì)胞。見表1。

2.4 胞膜、胞質(zhì)PKC活性變化 Kaolin組動(dòng)物術(shù)后第1天上頸髓神經(jīng)細(xì)胞胞膜PKC活性就開始增高,第7～14天達(dá)到最高峰,21 d開始回落;胞質(zhì)PKC活性則出現(xiàn)相反變化趨勢(shì),即術(shù)后第1天開始降低,7～14 d達(dá)到最低點(diǎn),21 d有所回升。定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):Kaolin組動(dòng)物術(shù)后1 d胞膜PKC活性增加70%;7～14 d達(dá)到最高點(diǎn),增加3倍之多;21 d開始回落,但仍高于正常 (P＜0.05)。胞質(zhì)PKC活性呈相反趨勢(shì),術(shù)后1 d出現(xiàn)降低;7～14 d達(dá)到最低點(diǎn),降幅達(dá)50%;21 d開始回升,但仍低于正常對(duì)照組 (P＜0.05)。見表1。

表1 動(dòng)物Tarlov評(píng)分、空洞前狀態(tài)中上頸髓凋亡細(xì)胞、Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞數(shù)百分比及胞質(zhì)和胞膜PKC活性變化 (n=8,x ±s)

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)上頸髓水腫程度(HE,×400)

圖2 術(shù)后7 d光鏡下細(xì)胞改變(×400)

3 討 論

凡與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因及抑癌基因都參與了對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控。研究較多的主要有 Bcl-2、c-myc、p53、fas/apo-1等。Bcl-2家族包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-1、Bcl-X和促進(jìn)凋亡的 Bax、Bak、Bcl-xs、Bik等,其中,Bcl-2是細(xì)胞凋亡的抑制基因,具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞抵抗多種損傷和抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bax是與 Bcl-2密切相關(guān)但功能相反的一組基因,它與Bcl-2以同源或異源二聚體形式發(fā)揮作用,參與細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)提示機(jī)體試圖上調(diào)靶基因Bcl-2抑制凋亡發(fā)生,但隨著病情進(jìn)展,結(jié)果是Bcl-2上調(diào)能力有限,反而促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Bax表達(dá)大大增加,明顯高于Bcl-2,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),胞膜PKC活性于術(shù)后第1天開始增高,第7～14天達(dá)到最高點(diǎn),21 d有所回落,胞質(zhì)PKC活性則出現(xiàn)相反變化趨勢(shì),即PKC出現(xiàn)了轉(zhuǎn)位激活。眾所周知,PKC激活主要由第二信使二?；视?DG)、磷脂酶D(PLD)和磷脂酶A2(PLA2)完成,其中前者對(duì)PKC激活是短暫的,而后兩者對(duì)PKC的激活是持續(xù)性的。因此推測(cè)脊髓空洞前狀態(tài)脊髓組織的PKC激活可能是由于Kaolin注入枕大池后,直接壓迫或(和)其導(dǎo)致的無菌性蛛網(wǎng)膜炎累及脊髓前后動(dòng)脈、靜脈,造成脊髓缺血、水腫、生物膜去極化:①引起多種神經(jīng)遞質(zhì)如興奮性氨基酸、乙酰膽堿的釋放,這些遞質(zhì)與其相應(yīng)的受體作用通過G蛋白介導(dǎo)機(jī)制,激活磷脂酶C(PLC),從而使DG增加,DG直接激活PKC,而 PKC的激活反過來又可激活 PLA2和 PLD,而PLA2和 PLD又參與 PKC持續(xù)激活,形成惡性循環(huán)〔7〕;②脊髓損傷后細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚可激活PLA2和 PLD,參與PKC持續(xù)激活,后者還促使細(xì)胞外 Ca2+內(nèi)流,進(jìn)一步激活PKC。

PKC是一種廣泛分布于哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞的鈣/磷依賴性激酶,在靜息狀態(tài)下以無活性形式存在于胞質(zhì)中,激活后轉(zhuǎn)位于細(xì)胞膜,通過磷酸化作用,在信號(hào)傳導(dǎo)過程中充當(dāng)?shù)诙攀?具有促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸塑形、細(xì)胞增生、基因表達(dá)等作用。近年來,它在細(xì)胞凋亡中的作用日益突出。本研究提示PKC活化引起了一系列下游事件,可能通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程而調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達(dá),參與了脊髓空洞前狀態(tài)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。Sitailo〔8〕在人類角化細(xì)胞的研究中證實(shí)PKC轉(zhuǎn)位激活能夠增加Bax表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。李云峰〔9〕在腦缺血再灌注模型中發(fā)現(xiàn)隨著PKC活性持續(xù)增加,Bcl-2表達(dá)也增高,提示了機(jī)體的抗凋亡作用。PKC是一種磷酸化蛋白,BCl-2一級(jí)結(jié)構(gòu)有7個(gè)絲氨酸殘基,PKC可使之磷酸化,從而活化Bcl-2,使之發(fā)揮抑制凋亡的作用。然而,PKC作為第二信使和第三信使之間的橋梁,還可以通過核因子-κB將胞質(zhì)的信號(hào)傳入核內(nèi),從而促進(jìn)Bax的表達(dá),促使細(xì)胞凋亡?？傊?在實(shí)驗(yàn)性脊髓空洞前狀態(tài)發(fā)病過程中,由于PKC的轉(zhuǎn)位激活,通過直接或間接途徑,上調(diào)Bcl-2和Bax表達(dá),但 Bax表達(dá)顯著高于 Bcl-2,導(dǎo)致了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。

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