鄧秀玲 王 棟 劉淑萍

1.內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010017

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人們的生命，人體的實(shí)體腫瘤60%都發(fā)生在消化道，我國更是消化道腫瘤高發(fā)國家，平均每小時(shí)就有120個(gè)中國人罹患消化道腫瘤。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞異常增殖和分化有關(guān)，如何抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖能力，是腫瘤治療的一個(gè)基本問題 。本文研究蒙藥升陽十一味丸對體外培養(yǎng)的人三種消化系腫瘤細(xì)胞生長的影響，為尋找高效、低毒的抗癌新藥提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 培養(yǎng)基DMEM、1640為Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所生產(chǎn)，噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜 (DMSO)均為Sigama公司產(chǎn)品。蒙藥升陽十一味丸 (以下簡稱十一味丸)由內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，用PBS配成50mg/ml貯液，0.2mm濾膜過濾除菌4℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用培養(yǎng)液稀釋到所需濃度。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 MGC－803細(xì)胞由北京腫瘤研究所提供，于含慶大霉素80u/ml、10%滅活胎牛血清的DMEM的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，結(jié)腸癌LoVo(購自天津腫瘤醫(yī)院)、胰腺癌細(xì)PC－3(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞研究所)，于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置37℃、5%CO2溫箱中孵育，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為四組:陰性對照組 (只含腫瘤細(xì)胞，不加藥組)、陽性對照組 (紫杉醇處理組)、實(shí)驗(yàn)組 (不同藥物濃度處理組)和空白對照組 (只含培養(yǎng)基，不含細(xì)胞和藥)。

1.3 十一味丸對三種癌細(xì)胞的增殖抑制作用 采用MTT法［1］。取對數(shù)生長期的三種細(xì)胞，經(jīng)消化液消化后制成單細(xì)胞懸液，臺盤藍(lán)計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)接種96孔板，胃癌MGC－803細(xì)胞以3×104個(gè)/ml、結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞以2×104個(gè)/ml、胰腺癌PC－3細(xì)胞以5×104個(gè)/ml接種，每孔100ul，置37℃、5%CO2溫箱孵育24h。每孔再加含藥培養(yǎng)基100ul，結(jié)腸癌和胰腺癌設(shè)五個(gè)不同濃度處理組，至藥物終濃度分別為2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。胃癌設(shè)6個(gè)不同濃度處理組分別為:2.5mg/ml、 2.0mg/m1、 0.25mg/ml、 0.63mg/ml、0.31mg/ml、0.15mg/ml。另設(shè)陰性對照組 (只有細(xì)胞，不加藥)和空白組 (只含等量培養(yǎng)基)，及紫杉醇陽性對照組，作用濃度為10－6mol/L，每組均為8個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)72h，每孔加20ulMTT(5 mg/ml)，37℃孵育4h，1500r/min離心10min，棄上清，每孔加200ulDMSO，恒溫振蕩器振蕩10min，使結(jié)晶物溶解。選擇570nm波長，酶標(biāo)儀上檢測各復(fù)孔吸光度 (A值)。進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，每組去除一個(gè)最大值和最小值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

抑制率 (%)=(對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/(對照組A值－空白組A值)×100%

1.4 三種細(xì)胞的形態(tài)變化觀察 MGC－803細(xì)胞、LOVO、PC－3細(xì)胞經(jīng)消化液消化后，臺盤藍(lán)計(jì)數(shù)以6×105個(gè)/ml接種75ml培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h，更換培養(yǎng)液，MGC－803對照組細(xì)胞用DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，LOVO和PC－3細(xì)胞對照組用1640繼續(xù)培養(yǎng);實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入含不同濃度十一味丸(2.5mg/ml、2.0mg/ml 、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml)的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)后每6h觀察細(xì)胞形態(tài)變化并作照相記錄。

2 結(jié)果

2.1 十一味丸對三種癌細(xì)胞的增殖抑制作用 從表1、2、3可見，十一味丸可明顯的抑制胃癌MGC－803細(xì)胞、結(jié)腸癌LoVo和胰腺癌PC－3細(xì)胞的生長，實(shí)驗(yàn)組吸光度與對照組比較有顯著性差異 (P＜0.05)，表現(xiàn)出很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用。其 IC50分別為:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml。高濃度 (2.5mg/ml)對胰腺癌、胃癌細(xì)胞所表現(xiàn)的增殖抑制作用，與陽性對照組紫杉醇處理組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，表明該藥在體外對這兩種細(xì)胞的增殖抑制作用與紫杉醇相當(dāng)。

表1 十一味丸對胃癌MGC－803細(xì)胞的增殖抑制作用

表2 十一味丸對結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞的抑制作用

表3 十一味丸對胰腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置光學(xué)顯微鏡下，胃癌MGC－803對照組細(xì)胞呈不規(guī)則多角形生長，細(xì)胞均質(zhì)而透明 ，核大居中，核仁明顯，生長旺盛。2.5mg/ml十一味處理MGC－803細(xì)胞后形態(tài)較對照組發(fā)生了明顯改變。處理12h既有少數(shù)細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞皺縮，24h后部分細(xì)胞已變圓，與周圍細(xì)胞脫離，體積變小，胞漿顆粒增多，細(xì)胞表面變得粗糙，出現(xiàn)“吐泡”現(xiàn)象，有些形似梅花狀改變，細(xì)胞數(shù)目減少。隨著作用時(shí)間的延長，貼壁細(xì)胞逐漸減少，呈“梅花狀”的細(xì)胞逐漸增多，為典型凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，有少量細(xì)胞脫落而懸浮于培養(yǎng)液中。正常培養(yǎng)的結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞呈上皮樣貼壁生長，胞體較大;經(jīng)該藥2.5mg/ml處理12h的LOVO細(xì)胞形態(tài)改變不明顯，細(xì)胞生長相對緩慢，至48h大部分細(xì)胞變圓，細(xì)胞周圍分泌物增加。胰腺癌PC－3細(xì)胞經(jīng)該藥2.5mg/ml處理后細(xì)胞生長緩慢，胞質(zhì)粗糙，細(xì)胞折光性下降。隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)目減少，不規(guī)則形狀的細(xì)胞增多，最后破碎壞死 。而對照組細(xì)胞呈類圓形貼壁生長，生長良好。

3 討論

蒙醫(yī)藥作為傳統(tǒng)民族醫(yī)學(xué)的一部分，具有顯著的民族和地域特色，理論獨(dú)特，蒙藥多用成藥且劑量小，具有高效、低毒發(fā)揮復(fù)合藥理作用、療效可靠等特點(diǎn)，已成為當(dāng)今抗腫瘤藥物或免疫調(diào)節(jié)藥物等新藥開發(fā)的研究熱點(diǎn)之一［2］。

升陽十一味丸是由黃精、玉竹、天花粉、藜蒺等十一味單方組成的復(fù)方蒙藥，臨床上用于治療胃寒、消化不良、寒性腹瀉等癥。組方中有許多單方具有抗腫瘤的藥理作用［3，4，5］，但單方不能反映復(fù)方蒙藥的藥理作用及蒙醫(yī)學(xué)的理論體系，況且蒙醫(yī)學(xué)對消化系腫瘤又有自己獨(dú)特的認(rèn)識與治療方法［6］。本實(shí)驗(yàn)采用人們較為推崇的體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)－MTT法，觀察十一味丸對胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，該藥能顯著抑制體外培養(yǎng)的三種消化系腫瘤細(xì)胞的生長 (P＜0.05)，計(jì)算其IC50值分別為:1.57mg/ml、0.66mg/ml、0.91mg/ml，且抑制作用隨藥物濃度的增加而增強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的增加其抑制作用也在增強(qiáng)。經(jīng)該藥作用后三種細(xì)胞最高抑制率＞50%，表明該藥對這三種細(xì)胞系均敏感。當(dāng)藥物濃度＞0.63mg/ml，該藥可抑制胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌細(xì)胞的增殖或引起細(xì)胞死亡;當(dāng)藥物濃度較低時(shí)，三種細(xì)胞生長抑制率＜30%，表明該濃度下對細(xì)胞的增殖抑制作用不理想。不同癌細(xì)胞接受同一種藥物作用的能力是有差別的，本實(shí)驗(yàn)中，在同一濃度范圍內(nèi)十一味丸對胃癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制作用較強(qiáng)，與紫杉醇的抑制作用相當(dāng) (P＞0.05)，最高抑制率達(dá)80%以上;而對胰腺癌的作用相對較弱。十一味丸抑制三種消化系腫瘤細(xì)胞增殖，表現(xiàn)出濃度、時(shí)間依賴性，這與某些中藥復(fù)方抗癌作用效果的報(bào)道相一致［7，8，9，10］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)同一種藥物引起不同細(xì)胞增殖抑制的作用方式也有所不同，十一味丸作用于胃癌細(xì)胞后出現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變;而結(jié)腸癌、胰腺癌細(xì)胞經(jīng)十一味丸處理后的形態(tài)改變趨向壞死。同時(shí)在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，低濃度 (＜1.25mg/ml)藥物處理后細(xì)胞生長緩慢，但早期形態(tài)改變不明顯。這一結(jié)果可為臨床應(yīng)用蒙藥治療消化道腫瘤提供一定的理論參考價(jià)值。本文對該蒙藥抑制三種消化系腫瘤細(xì)胞的增殖只做了初步探討，具體的作用機(jī)制還需深入研究，從而為抗癌蒙藥進(jìn)一步應(yīng)用提供一些新思路。

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