張曉君 王愛魚 丁瑞峰

(包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化科 內(nèi)蒙古包頭 014010)

細胞凋亡對多細胞有機體的發(fā)育、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定致關(guān)重要,他的異常與腫瘤發(fā)生密不可分。近年發(fā)現(xiàn)胃癌中不僅存在細胞增生,同時也存在細胞凋亡,胃癌的發(fā)生是細胞凋亡與增生比例失調(diào)的結(jié)果。大量研究證明NO既有細胞保護作用,亦有細胞損傷作用。NO在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中可能起到一定作用,但是,在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中NO水平及胃黏膜細胞凋亡的關(guān)系如何有待于進一步證實。為此,本實驗通過檢測NO在慢性胃病血清中的含量及觀察胃黏膜組織細胞凋亡的情況來探討NO含量與胃黏膜細胞凋亡的關(guān)系,為闡述NO在胃癌中的作用提供實驗依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 觀察對象

于2008年8至月2009年10月在本院胃鏡室就診的慢性胃病及胃癌患者132例,胃鏡下顯示為慢性胃炎和胃癌患者于其病變處取3塊活檢,1塊用AF液固定(備用做切片觀察細胞凋亡),2塊送病理做病理分型,評定結(jié)果采用悉尼分類法。胃鏡取材后隨即抽取患者血液2mL,離心收集血清0.5mL置于-20℃冰箱中備用。經(jīng)病理診斷為慢性淺表性胃炎為40例,萎縮性胃炎(含腸化生、異型增生)60例,胃癌32例,男性88例,女性44例,年齡17～73歲,平均年齡(53.9±12.4)歲。

1.3 方法

1.3.1 NO含量的檢測 采用亞硝基還原法檢測NO的含量,一氧化氮試劑盒由南京建成生物技術(shù)有限公司提供,操作程序嚴格按試劑說明書進行,根據(jù)公式計算NO含量。

1.3.2 凋亡細胞數(shù)的檢測 采用熒光染色法檢測細胞凋亡數(shù),Hoechst染色試劑盒由江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司提供。常規(guī)石蠟包埋,切片,貼片與烤片,脫蠟與水化后PBS液洗兩遍,每次3min,加入0.5mL Hoechst33258熒光染色液,染色5min,再去染色液:用PBS液洗兩遍,每次3min,然后滴一滴抗淬滅封片液,蓋上潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。用激發(fā)波長350nm左右的熒光濾片,可檢測到致密濃染的藍色細胞核。每張切片用40×10的物鏡至少連續(xù)觀察5個視野,每個視野計數(shù)100個上皮細胞中的凋亡細胞數(shù),以平均數(shù)為凋亡指數(shù)(AI)。

表1 不同病變組NO檢測值與細胞凋亡情況的比較(±s)

表1 不同病變組NO檢測值與細胞凋亡情況的比較(±s)

注:與淺表性胃炎比較,*P<0.01,#P>0.05

例數(shù) NO(umol/L)AI(%）淺表性胃炎萎縮性胃炎胃 癌40 60 32 66.74±19.25(80.31±16.31)*(95.81±13.82)*5.29±1.65(8.45±1.78)*(4.71±1.36)#

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

淺表性胃炎組,萎縮組,胃癌組血清NO含量分別為(66.74±19.25)umol/L,(80.31±16.31)umol/L,(95.81±13.82)umol/L淺表組＞萎縮組＞胃癌組(P<0.01);淺表性胃炎組,萎縮組,胃癌組胃粘膜凋亡指數(shù)(AI)分別為(5.29±1.65),(8.45±1.78),(4.71±1.36)萎縮組＞淺表組(P<0.01),胃癌組與淺表組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),結(jié)果見表1。

3 討論

胃癌嚴重影響著患者的健康和生命,迄今為止,人們對胃癌的認識仍然有限,雖然已經(jīng)有很多腫瘤標志物方面的研究,但是仍然沒有全面揭開腫瘤之謎。研究發(fā)現(xiàn)NO在腫瘤的發(fā)展方面具有重要作用,對NO的研究可能揭開胃癌研究的新領(lǐng)域。

大量的研究和實驗發(fā)現(xiàn)由NO引起的凋亡在許多不同種類的鼠和人的細胞中都可被觀察到。通過觀察發(fā)現(xiàn),由NO引發(fā)的細胞凋亡途徑類似于在依賴線粒體凋亡途徑中已查明的信號通路,但前者更強調(diào)凋亡執(zhí)行過程中作為NO目的分子的腫瘤抑制因子p53的作用。實驗表明p53在NO調(diào)控細胞周期調(diào)節(jié)因子或凋亡蛋白(如p21或Bax)的過程中是不可或缺的。NO引發(fā)的凋亡其啟動方式在不同生物的細胞中是有所不同的,在通常情況下,NO是通過線粒體介導(dǎo)的途徑引起細胞凋亡的[1]。另一方面,巨噬細胞等在激活或某些病理條件下大量合成釋放NO發(fā)揮細胞毒作用。NO氧化生成終末代謝產(chǎn)物為NO3和NO2等,它們比NO更活潑,細胞毒性更大,可氧化DNA,造成鏈斷裂,交叉聯(lián)結(jié)和堿基修飾等多種DNA損害,從而誘發(fā)細胞凋亡[2]。

本研究結(jié)果顯示,NO的含量在各病變組為:胃癌組>萎縮(腸化,異型增生)組>慢性淺表胃炎組(P<0.01),慢性萎縮性(腸化生,異型增生)組的AI值均大于慢性淺表性胃炎組(P<0.01),而胃癌的AI值與慢性淺表性胃炎的比較無明顯差異(P>0.05),這與晏楠[3],李子俊[4],尹春華等[5]研究結(jié)果相似。該結(jié)果提示NO可能與胃癌前病變的關(guān)系密切。細胞凋亡的增加一則可導(dǎo)致胃黏膜的萎縮,萎縮性胃炎的形成及胃酸和胃蛋白酶的減少均能增加胃癌發(fā)生的危險性。二則由于為了維持胃黏膜的完整性,胃黏膜細胞代償性的增殖加快,而在細胞增殖過程中可能出現(xiàn)不正常的增加,有可能與胃癌的發(fā)生有關(guān)。另外胃癌中AI的降低可能與早期胃癌中,多種原因使野生型p53基因轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃?而后者有明顯的抑制凋亡作用有關(guān)。

另外,P53與bcl-2在細胞凋亡中的作用已被證實,NO促進細胞凋亡可能是通過促使p53聚集,下調(diào)bcl-2,使bax過度表達從而激活caspases蛋白和使DNA裂解[6]。但是NO促進HP引起細胞凋亡的通路還未明了。胃癌的發(fā)生是多階段,多基因調(diào)控的進展過程,本實驗僅是初步工作,具體機制還有待于進一步研究。

[1]張而立,李松,陳暢,等.一氧化氮與細胞凋亡關(guān)系的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2007,28(6):427～429.

[2]辛敏,羅偉生.幽門螺桿菌與一氧化氮關(guān)系研究進展[J].廣東醫(yī)學(xué),2006,27(3):432～434.

[3]晏楠,呂農(nóng)華,陳江.幽門螺桿菌感染與細胞凋亡及一氧化氮[J].世界華人消化雜志,2000,8(S):93.

[4]李子俊,陳顏芳,林秋雄,等.一氧化氮在幽門螺桿菌相關(guān)性胃病中的可能作用[J].現(xiàn)代消化介入治療,2000,5(2):35～37.

[5]尹春華,張萬岱,曾錦章,等.幽門螺桿菌感染者血清一氧化氮水平及胃粘膜細胞凋亡的變化[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志,2000,8(4):219～220.

[6]Borutaite V,Morkuniene R,Brown GC.Nit ric oxide donors,nit rosot hils,and mitochondrial respiration inhibitors inducecaspase activation by different mechanisms[J].Febs Lett,2000,467(2～3):155～159.