皮晉魁，張煥容

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

本試驗(yàn)采用水稀釋法初提IgY，然后分別用硫酸銨沉淀法和冰乙醇分級(jí)沉淀法進(jìn)一步提取IgY，檢測IgY提取量、純度以及活性效價(jià)，為選擇較好的雞卵黃免疫球蛋白（IgY）提取方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 新鮮雞蛋 購自成都農(nóng)業(yè)科技職業(yè)學(xué)院實(shí)訓(xùn)中心。

1.1.2 主要設(shè)備和試劑 高速冷凍離心機(jī)centrifuge 5804、移液器（Eppendorf公司，德國）；電子天平（METTER TOLEDO公司，瑞士）；凝膠成像系統(tǒng)VerSa Doc2000、蛋白電泳儀、核酸蛋白檢測儀（Bio-Rad公司，美國）。

0.1mol/L PBS（pH 7.4），0.028mol/L NaCl溶液，95%冰乙醇（-20℃預(yù)冷），考馬斯亮藍(lán)染液，SDSPAGE脫色液，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%過硫酸銨，TEMED；0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.8），0.1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）；1000μg/mL結(jié)晶牛血清白蛋白，禽流感病毒H9亞型和新城疫病毒雞胚尿囊液。

1.2 提取方法及步驟

1.2.1 卵黃液中水溶性成分（WSF）的分離 新鮮雞蛋用卵黃分離器去除蛋白，之后將卵黃于濾紙上滾動(dòng)，吸干，刺破卵黃膜，收集卵黃液。每枚雞蛋抽取10mL卵黃液，分別置于離心管中，以8倍量去離子水稀釋，攪拌10min，使水溶性IgY充分溶出。用0.1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.2，4℃靜置過夜，然后10000 r/min，4℃離心25min，收集上清液，即得到澄清WSF。

1.2.2 冰乙醇分級(jí)沉淀法純化IgY 取一半制備好的WSF，向其中加入95%冰乙醇，使冰乙醇終濃度達(dá)到60%（V/V），離心（10000 r/min，4℃，25min），沉淀用0.028mol/L NaCl溶解，過濾，去除脂蛋白沉淀，濾液再用終濃度為30%的95%冰乙醇沉淀后離心，離心后的沉淀即為IgY，于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的 PBS。

1.2.3 硫酸銨沉淀法純化IgY 取另一半WSF與等體積的0.lmol/L pH 7.4的 PBS混合,攪拌均勻，4℃下逐滴緩慢加入pH 7.0的飽和硫酸銨，至飽和度40%。4℃靜置過夜，然后于4℃下11000 r/min離心25min，棄上清，沉淀用與WFS等體積的0.1mol/L pH 7.4的PBS溶解，混合均勻后再逐滴加入飽和硫酸銨至飽和度35%。4℃靜置過夜，再11 000 r/min離心25min，棄上清，于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的PBS。

1.2.4 SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳） 將冰乙醇法和硫酸銨沉淀法提取的樣品各5份和卵黃液樣品1份各30μL分別置1.5mL離心管中，加入上樣緩沖液30μL，置沸水浴5min，待用。灌制8%分離膠，在分離膠頂部加入水飽和異丁醇，讓凝膠聚合半小時(shí)。灌制5%濃縮膠，并將梳子插入濃縮膠液體中，讓凝膠聚合30min。小心拔出梳子，加入電極緩沖液，在加樣孔中依次加入樣品以及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。接通電源，電壓90 V下電泳，待藍(lán)色指示劑進(jìn)入分離膠后改變電壓為120 V繼續(xù)電泳，在藍(lán)色指示劑到達(dá)凝膠底部后關(guān)閉電源。凝膠沖洗后放入表面皿中，加入考馬斯亮藍(lán)染液浸染（覆蓋凝膠），置水平搖床上輕微搖動(dòng)染色1 h。傾去染色液，以脫色液覆蓋凝膠，置水平搖床輕微搖動(dòng)脫色過夜，然后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.5 IgY血凝抑制效價(jià)測定 參照文獻(xiàn)檢測冰乙醇法、硫酸銨沉淀法所提取的樣品和卵黃液樣品中的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)。

1.2.6 用考馬斯亮藍(lán)G250測定IgY蛋白含量 分別取12只試管編號(hào)，其中BSA標(biāo)準(zhǔn)品為1～6號(hào)，硫酸銨沉淀法提取樣品為水1～水3號(hào)，冰乙醇法提取樣品為醇1～醇3號(hào)。按表1要求加入試劑，振蕩混勻后于室溫下放置5～10min，用核酸蛋白檢測儀在595nm處檢測樣品吸光度值，以不含BSA的吸光度值為空白對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)蛋白含量值為橫坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白含量，進(jìn)而計(jì)算出樣品中的蛋白質(zhì)含量。

表1 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的稀釋

2 結(jié)果

2.1 SDS-PAGE檢測結(jié)果 由圖1可知，SDS-PAGE凝膠條帶顯示的提純蛋白主要集中在60～70KD之間。IgY蛋白重鏈為67KD，與卵黃總蛋白條帶相比，兩種方法都有效地純化出了卵黃抗體IgY，但水稀釋-硫酸銨沉淀法提純的IgY要遠(yuǎn)多于冰乙醇分級(jí)沉淀法的提純量。

圖1 兩種方法提取的IgY作SDS-PAGE檢測

2.2 IgY血凝抑制效價(jià)檢測結(jié)果 各樣品IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)見表2和表3。水稀釋-硫酸銨沉淀法提純的各IgY樣品抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的平均血凝抑制效價(jià)分別為6.8和9.4，均高于冰乙醇法提取的IgY效價(jià)4.4和5.8，而卵黃液抗體抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的平均血凝抑制效價(jià)分別為7.2和8。

表2 各樣品抗新城疫病毒的血凝抑制效價(jià)

表3 各樣品抗禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)

2.3 IgY蛋白含量檢測結(jié)果 根據(jù)表4中蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值建立圖2所示的蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2=0.9717，回歸方程為y=0.0012x+0.8769。將兩種純化方法提取的樣品吸光度值（OD值）帶入回歸方程，計(jì)算得出各樣品的蛋白含量，見表6。兩種方法純化后的卵黃抗體IgY濃度見表7。飽和硫酸銨沉淀法提取IgY的產(chǎn)率為829.67μg/mL，冰乙醇分級(jí)沉淀法提取IgY的產(chǎn)率為409.75μg/mL。

表4 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值

圖2 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

表5 兩種純化方法提取樣品的吸光度值

表6 兩種純化方法提取樣品的蛋白含量 μg

表7 每1mL卵黃原液純化后的IgY濃度 μg/mL

3 討論

用硫酸銨沉淀法提取的IgY含量高于冰乙醇分級(jí)沉淀法，這個(gè)結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致。SDSPAGE電泳結(jié)果顯示，各樣品最主要的條帶基本分布在60～70KD之間，與IgY重鏈67KD大小相吻合；另外，25～30KD間兩種方法均有一條比較淡的條帶，屬于IgY輕鏈。由SDS-PAGE電泳結(jié)果可以看出，兩種方法所提取的IgY純度均比較高。根據(jù)文獻(xiàn)，IgY各種提取方法均對(duì)其活性有一定影響。本試驗(yàn)中水稀釋-硫酸銨沉淀法提取的IgY抗新城疫病毒和禽流感病毒H9亞型的血凝抑制效價(jià)與卵黃液血凝抑制效價(jià)相當(dāng)，而水稀釋-硫酸銨沉淀法提取的IgY效價(jià)高于冰乙醇提取法，與文獻(xiàn)中報(bào)道的水稀釋-硫酸鹽提取法對(duì)蛋白活性影響較小相吻合。綜上，水稀釋-硫酸銨沉淀法較冰乙醇法提取的IgY的產(chǎn)率和活性均更高，是相對(duì)較好的提取IgY的方法。

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