敖 利 陳 玲 宋 健

重慶市中醫(yī)院（重慶400021）

通絡(luò)解毒緩釋凝膠劑是本院的自制制劑，主要用于治療常見難治性四肢血管疾病，亦可用于治療毒蟲叮咬、燒燙傷、褥瘡等皮膚損傷、感染、瘡瘍性疾病，具有開通經(jīng)絡(luò)、活血鎮(zhèn)痛、解毒消腫的功效。為控制該制劑產(chǎn)品質(zhì)量，本試驗(yàn)對其進(jìn)行了薄層色譜鑒別研究，建立了黃連、馬錢子的薄層色譜鑒別方法，并就用藥安全性，進(jìn)行了動物皮膚急性毒性試驗(yàn)研究。

1 材 料

1.1 儀器PBQ-I型薄層自動鋪板器 （重慶南岸新力儀器廠）；AE-200型電子天平（天津METTLER公司）；UV-1型三用紫外分析儀 （上海顧村電光儀器廠）；Q-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）；微量進(jìn)樣器（上海醫(yī)用激光設(shè)備廠），HH-S11-2型電熱恒溫水浴鍋 （上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），薄層層析硅膠G（青島海洋化工集團(tuán)公司）。羧甲基纖維素鈉鹽800-1200（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），化學(xué)純。

1.2 試藥通絡(luò)解毒凝膠劑（由本院藥物研究部提供，批號為20110112，原生藥含量 20g/100g）。 鹽酸小檗堿 （110713-200609），士的寧（110705-200306），馬錢子堿 （10716-200208），馬錢子（121164-200302）、黃連 （11913-200202）均由中國藥品生物制品檢定所提供。正丁醇、冰醋酸、甲苯、丙酮、乙醇、氨水、碘化鉀、堿式硝酸鉍均為AR。

1.3 動物健康成年白色家兔16只，雌雄各半，體質(zhì)量2.0～2.2kg，一級合格，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，溫度（23±2）℃，濕度（60±10）%。 試驗(yàn)期間動物單獨(dú)分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水與攝食。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃連的薄層色譜鑒別

2.1.1 溶液的制備 取本品10g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20mL，超聲處理30min，濾過，濾液濃縮至10mL，作為供試品溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對照品溶液。取黃連對照藥材粉末100mg，加甲醇10mL，加熱回流15min，濾過，濾液補(bǔ)加甲醇至10mL，作為對照藥材溶液。稱取馬錢子藥材粉末500mg，加三氯甲烷-乙醇（10∶1）混合溶液5mL與濃氨試液0.5mL，密塞，振搖5min，放置2h，濾過，濾液作為陰性對照溶液。

2.1.2 薄層層析 照薄層色譜法［1］（2005年版《中國藥典（一部附錄ⅥB）》）試驗(yàn)，取上述 4種溶液各 10μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%CMC-Na為粘合劑的硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下（365nm）下檢視。 檢視：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色、綠色熒光斑點(diǎn)，在對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的一個綠色熒光斑點(diǎn)。陰性對照無干擾。見圖1。

圖1 薄層色譜圖

2.2 馬錢子的薄層色譜法（TLC）鑒別

2.2.1 溶液制備 取本品10g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20mL，超聲處理30min，，濾過，濾液濃縮至5mL，作為供試品溶液。取士的寧對照品，馬錢子堿對照品，加三氯甲烷制成每1mL各含2mg的混合溶液，作為對照品溶液。稱取馬錢子對照藥材粉末500mg，加三氯甲烷-乙醇 （10∶1）混合溶液5mL與濃氨試液0.5mL，密塞，振搖5min，放置2h，濾過，濾液作為對照藥材溶液。陰性對照溶液：取黃連藥材粉末100mg，加甲醇10mL，加熱回流15min，濾過，濾液補(bǔ)加甲醇使成10mL，作為陰性對照溶液。

2.2.2 薄層層析 薄層色譜法［1］（2005年版《中國藥典（一部附錄ⅥB）》）試驗(yàn)，吸取上述對照品溶液、對照藥材溶液、陰性對照溶液各10μL，供試品溶液20μL，分別點(diǎn)于同一以0.3%CMC-Na為粘合劑的硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液（4∶5∶0.6∶0.4）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。檢視：供試品色譜中，在與對照品、對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的橘紅色斑點(diǎn)。陰性對照無干擾。見圖1。

2.3 皮膚急性毒性試驗(yàn)

2.3.1分組及給藥 家兔分為完整皮膚受試藥組，完整皮膚（賦形劑）對照組，破損皮膚受試組，破損皮膚（賦形劑）對照組，每組4只。于給藥前24h，用8%硫化鈉將背部脊柱兩側(cè)去毛（10%體表面積，約150cm2）。去毛后24h檢查去毛皮膚無受傷。破損皮膚的制作采用滅菌注射針頭將去毛消毒皮膚“#”字型劃破，以輕度滲血為度。通絡(luò)解毒凝膠劑取5g均勻地涂敷于動物背部脫毛區(qū)，破損皮膚則在脫毛區(qū)劃破皮膚后再涂敷于受試物，并用玻璃紙和兩層紗布固定。每只動物分籠飼養(yǎng)。敷受試物24h后，用溫水去除殘留受試物。去除受試藥物后1、24、48、72h至第7日，每日觀察并記錄動物的全身中毒表現(xiàn)和死亡情況，包括動物體質(zhì)量、皮膚、毛發(fā)、眼睛和黏膜的變化，呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動等變化。若有死亡動物應(yīng)及時進(jìn)行尸檢和肉眼觀察。當(dāng)有肉眼可見的病變時，則需要進(jìn)行病理學(xué)檢查。

2.3.2 試驗(yàn)結(jié)果 通絡(luò)解毒凝膠劑均勻涂抹動物24h，完整皮膚及破損皮膚家兔皮毛光澤正常，對家兔的飲食、行為活動、精神狀態(tài)、大小便及其顏色、呼吸、鼻、眼、口腔分泌物均未造成影響。破損皮膚均在給藥后2d出現(xiàn)點(diǎn)狀血痂，7d內(nèi)脫痂痊愈。連續(xù)觀察14d亦未見異常，未出現(xiàn)急性毒性反應(yīng)，無死亡。試驗(yàn)前后家兔體質(zhì)量呈正常增長狀態(tài)。見表1。

表1 家兔皮膚急性毒性試驗(yàn)前后體質(zhì)量比較 （kg，±s）

表1 家兔皮膚急性毒性試驗(yàn)前后體質(zhì)量比較 （kg，±s）

第14日破損皮膚對照組 2.30±0.02破損皮膚受試組 2.38±0.05組 別完整皮膚對照組2.55±0.19完整皮膚受試組2.45±0.13 n44 4 4第1日2.05±0.06 2.12±0.15 2.20±0.11 2.15±0.07

3 討 論

通絡(luò)解毒凝膠劑方中黃連、馬錢子的主要有效成分均為生物堿［2］，因此對照品分別選用鹽酸小檗堿、士的寧、馬錢子堿。本薄層色譜鑒別進(jìn)行了方法學(xué)研究，對供試品的制備、展開劑、薄層板、顯色劑等條件進(jìn)行了篩選試驗(yàn)。經(jīng)試驗(yàn)，黃連的展開劑從苯-乙酸乙酯-丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.3）和正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）中選用后者，馬錢子的展開劑從丙酮-氯仿-濃氨水（30∶15∶1）和甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液（4∶5∶0.6∶0.4）中選用后者。經(jīng)試驗(yàn)，采用本文所選方法鑒別效果好，方法簡便易行，斑點(diǎn)分離清晰，重現(xiàn)性、專屬性好，陰性對照無干擾。

通絡(luò)解毒凝膠劑均勻涂抹動物24h，未見毒性癥狀表現(xiàn)，連續(xù)觀察14d亦未見異常。實(shí)驗(yàn)家兔體質(zhì)量增長正常。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時解剖肉眼未見明顯病理改變。從本品的急性毒性所試濃度以及給藥后毒性表現(xiàn)判斷，本制劑的應(yīng)用是安全的。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：34，213.

［2］謝秀瓊.中藥新制劑開發(fā)與應(yīng)用［M］.北京：人民衛(wèi)出生版社，2002：565－570.