張 旭，胡 艷，蔣桂韜，王向榮，李昊幫，戴求仲

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131）

雞蛋是一種營養(yǎng)豐富的食品，是居民主要消費(fèi)的畜產(chǎn)品之一。雞蛋中膽固醇的含量較高，約為213mg·個-1，為滿足不同人群的需要，低膽固醇雞蛋等具有一定保健功能的雞蛋受到人們關(guān)注，因而有必要對雞蛋的膽固醇含量進(jìn)行分析[1-5]。另外，目前市場上雞蛋品種繁多，生產(chǎn)者或研究者需要對雞蛋的營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，從而評定其營養(yǎng)價(jià)值，這些都需要有準(zhǔn)確的分析雞蛋膽固醇含量的方法。膽固醇主要存在于蛋黃中，因此，測定雞蛋中膽固醇含量多以蛋黃為樣本進(jìn)行測定。膽固醇含量的分析方法有酶法、比色法、液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，試劑盒法是基于酶法測定膽固醇的原理進(jìn)行的，比色法一種依據(jù)顯色反應(yīng)來分析的傳統(tǒng)方法，色譜法是適用范圍較廣、靈敏度較高的分析方法，而高效液相色譜不需要載氣，在使用上較氣相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法簡便[6-11]。本試驗(yàn)對液相色譜法、皂化-比色法和試劑盒法測定蛋黃膽固醇的過程和結(jié)果進(jìn)行研究和比較，為雞蛋膽固醇含量測定工作提供方法指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蛋黃由市售新鮮雞蛋中取出；膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99.7%（由中國計(jì)量科學(xué)研究院提供）；總膽固醇試劑盒（酶法）由北京北化康泰臨床試劑有限公司提供；顯色液為FeSO4-冰乙酸-濃硫酸，將Fe?SO4100mg溶于1mL蒸餾水中，再加入100 mL冰乙酸混合溶解，然后與100 mL濃硫酸緩慢混勻，冷卻后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC法

取新鮮蛋黃稀釋液（濃度為0.1 g·mL-1）1.0 mL于10 mL離心管中，加入95%乙醇1.0 mL，用漩渦振蕩器混勻后，加入乙醚2.5 mL，再次混勻后加入石油醚2.5 mL，震蕩混勻，3000 rpm離心5 min，移出上層萃取液，在低于45℃下用氮?dú)獯蹈?，加無水乙醇溶解殘余物2.0 mL，用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。色譜條件為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm；流動相：乙腈-異丙醇（4∶1，V/V）；流速：0.8 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用色譜級無水乙醇溶解配成濃度為1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，取標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成不同濃度（0～1000 μg·mL-1），以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用外標(biāo)法定量分析樣品中膽固醇含量。

1.2.2 皂化-比色法

稱取鮮蛋黃100mg于25 mL試管中，加入KOH-甲醇溶液5 mL（200 g·L-1），漩渦震蕩混勻，置于80℃水浴恒溫振蕩器中皂化10 min，取出冷卻至室溫，加入正己烷10 mL，漩渦震蕩混勻，靜置，將上層液體移入10 mL離心管中，3000 rpm離心10 min，取出上清液60℃下用氮?dú)獯蹈?。然后加入冰乙? mL溶解殘余物，再加入顯色液3 mL于60℃水浴15 min，在490 nm下用722分光光度計(jì)進(jìn)行比色分析，同法做空白樣。將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解配成1mg·mL-1溶液，取不同體積膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液與樣品做同樣處理，以膽固醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)制作工作曲線。根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算樣品中膽固醇含量。

1.2.3 試劑盒法

樣品前處理方法同1.2.1，根據(jù)試劑盒說明將樣品與工作液混合，37℃保溫5 min后，在波長500 nm處比色測定吸光度值，并根據(jù)樣品管和校準(zhǔn)管的吸光度值及校準(zhǔn)品濃度計(jì)算膽固醇含量，計(jì)算式見式（1）。

1.2.4 加標(biāo)回收率的測定

量取0.1 g·mL-1新鮮蛋黃稀釋液0.5 mL或新鮮蛋黃50mg，加入1mg·mL-1的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液750 μL，按照上述3種方法進(jìn)行處理并分析，根據(jù)結(jié)果計(jì)算加標(biāo)回收率。計(jì)算公式見式（2）。

其中，a為測得加標(biāo)樣中膽固醇的量，b為樣品中膽固醇的量，c為加標(biāo)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 HPLC法測定蛋黃膽固醇含量

樣品的高效液相色譜圖見附圖。

由附圖可知，膽固醇的保留時(shí)間為14.662 min。

2.2 測定結(jié)果比較

3種方法測定結(jié)果見附表。

通過對3種方法的比較發(fā)現(xiàn)，HPLC法的測定結(jié)果低于皂化-比色法，但差異不顯著（P＞0.05），而試劑盒法的測定結(jié)果較HPLC法高（P＜0.05），這與Nogueira的結(jié)果相一致[12]。

附圖 樣品的液相色譜圖

附表 3種測膽固醇方法比較%

目前我國產(chǎn)膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，其測定原理是膽固醇在膽固醇氧化酶的作用下生成膽甾烯酮，再與氨基安替吡啉反應(yīng)生成紅色醌化物，醌化物顏色深淺與膽固醇含量成正比，試劑盒法測定結(jié)果較高的原因可能是蛋黃中固醇以外的甾醇類物質(zhì)也同氨基安替吡啉反應(yīng)生成有色物，使測定結(jié)果偏高[13]。HPLC法測定蛋黃膽固醇結(jié)果的偏差最小，方法的重現(xiàn)性和再現(xiàn)性也好于其他兩種方法，因而HPLC法的精密度較高。皂化-比色法的偏差較大，其原因可能是此法采用皂化、顯色等多步操作，增加了由儀器、試劑和操作等方面帶來的系統(tǒng)誤差，另外，蛋黃中膽固醇以外的物質(zhì)也可能與硫酸反應(yīng)而生成有色物，給測定結(jié)果帶來干擾。試劑盒法的精密度最低，這可能與蛋黃樣品中干擾物質(zhì)較多有關(guān)。在樣品中加入膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品分析加標(biāo)回收率的結(jié)果表明，HPLC法的回收率最好，因而準(zhǔn)確度最高，皂化-比色法居中，試劑盒法的準(zhǔn)確度最低。皂化-比色法的加標(biāo)回收率偏低，可能與膽固醇皂化不完全有關(guān)，皂化時(shí)間短，樣品中膽固醇未能被完全皂化，但皂化時(shí)間長又可能會使樣品中增加膽固醇以外的皂化產(chǎn)物而干擾測定結(jié)果。試劑盒法的加標(biāo)回收率偏高，一方面與甾醇干擾有關(guān)，另一方面，本研究采用手工量取試液在722分光光度計(jì)上進(jìn)行分析，而非全自動機(jī)器操作，增大了系統(tǒng)誤差。

3 討論

這3種測定方法中HPLC法以其高效、高速、高靈敏度的特點(diǎn)成為測定蛋黃膽固醇含量最準(zhǔn)確的方法，皂化-比色法檢測雖然不需要昂貴的儀器，但顯色液使用濃硫酸配制，使用和分析過程中有一定危險(xiǎn)，且蛋黃中干擾物質(zhì)多使測定的結(jié)果偏差較大[14]。在采用皂化-比色法分析時(shí)，為了提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究用膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品制作工作曲線而非標(biāo)準(zhǔn)曲線，即將膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品做皂化和提取處理，然后加入顯色液，整個處理過程與樣品相同。目前我國產(chǎn)膽固醇試劑盒均為血清總膽固醇試劑盒，用試劑盒測定血清膽固醇的方法已被廣泛使用，但用血清總膽固醇試劑盒測定蛋黃膽固醇含量存在結(jié)果偏高，偏差大的問題。譚觀岳等在對鰻魚的試驗(yàn)中也得到相似的結(jié)論，另有研究者將氣相色譜法測定的結(jié)果與試劑盒法比較發(fā)現(xiàn)，試劑盒法的測定結(jié)果也偏高，而色譜法能夠?qū)⒛懝檀己推渌薮加行У姆蛛x，準(zhǔn)確度高[15-16]。

采用HPLC法測蛋黃膽固醇應(yīng)使用新鮮蛋黃，不宜使用冷凍蛋黃樣品，蛋黃冷凍后會發(fā)生凝膠化而很難均勻分散在水中；樣品處理后用0.45 μm濾膜過濾至EP管中，應(yīng)盡量將EP管裝滿，以避免膽固醇與氧氣接觸而發(fā)生氧化；樣品前處理時(shí)萃取液采用氮吹儀吹干，亦可用真空干燥箱低溫烘干；流動相要脫氣，測樣時(shí)保持柱溫恒定，避免保留時(shí)間偏移。

4 結(jié) 論

高效液相色譜法測定蛋黃膽固醇含量，方法可靠、準(zhǔn)確、簡便，重現(xiàn)性和再現(xiàn)性好。皂化-比色法的準(zhǔn)確性較HPLC法低，較試劑盒法高。用總膽固醇試劑盒測定蛋黃膽固醇含量的結(jié)果偏高，不建議使用血清總膽固醇試劑盒來測定蛋黃的膽固醇含量。

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