王麗非，朱元軍，王松梅，杜郁，余騰斐，王麗，洪斌

干擾素（interferon，IFN）是一種具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性的細胞因子，能通過多種機制影響腫瘤細胞功能，促進免疫細胞的活性[1]。干擾素是一個大的基因家族，可分為3 型，主要包括 IFNα、IFNβ 和 IFNγ[2]。IFNβ 主要用于病毒性疾病、惡性腫瘤和自身免疫性疾病的治療[3]。1993年，美國 FDA 批準了 Chiron 公司生產(chǎn)的IFNβ-1b 上市銷售，其商品名為Betaseron，用于治療多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病。日本也批準了靜脈注射的 IFNβ 用于治療慢性乙型或丙型肝炎[4]。

盡管如干擾素、集落刺激因子等一些細胞因子已被開發(fā)成蛋白藥物用于臨床，但作為科研用試劑的細胞因子的開發(fā)在我國幾乎是一片空白，高價進口和受制于西方生物技術(shù)公司成為細胞因子來源的主要現(xiàn)狀。本工作在國家科技支撐計劃——“科研用細胞因子試劑平臺的完善和應(yīng)用研究”的支持下，采用高效的宿主系統(tǒng)和載體表達標簽化細胞因子——組氨酸標簽人 β 干擾素（HIS-IFNβ），實現(xiàn)了可溶性表達，并利用 Ni sepharose 親和層析的方法，分離得到高純度的 HIS-IFNβ，并進行了生物學活性的檢測，為科研用標簽化細胞因子試劑的研制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 菌株、細胞株、病毒株和質(zhì)粒 大腸桿菌E.coliTG1、E.coliBL21(DE3) 為本實驗室保存；人羊膜細胞（Wish細胞）購自中國科學院上海細胞中心；水泡性口膜炎病毒（VSV）為本研究所保存；質(zhì)粒載體 pGEM-T 購自美國 Promega 公司；質(zhì)粒載體 pET-16b 購自美國 Novogen 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 大腸桿菌培養(yǎng)基 LB 的配制參見分子克隆操作指南[5]；氨芐青霉素在 LB 培養(yǎng)基中使用濃度為100 μg/ml；Wish 細胞所用 MEM 培養(yǎng)基購自美國 Thermo scientific 公司。

1.1.3 工具酶和生化試劑 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等均購自日本 TaKaRa 公司；PfuDNA 聚合酶購自上海生物工程公司。TA 克隆試劑盒，購自美國 Promega 公司；UNIQ-10 柱式 DNA膠回收試劑盒，購自上海生物工程公司。人 β 干擾素抗體和組氨酸標簽抗體購自美國 R&D 公司；人 β 干擾素標準品購自中國藥品生物制品檢定所。

1.1.4 儀器 miniCycleTMPTC-200 型 PCR 儀為美國 MJ Research 公司產(chǎn)品；SEMI-DRY TRANSFER 轉(zhuǎn)膜儀為美國 Bio-Rad 公司產(chǎn)品；?KTA Explorer 系統(tǒng)為美國 GE Healthcare 公司產(chǎn)品；SHIMADZU-20A 型高效液相色譜儀為日本島津公司產(chǎn)品；C8 反相柱 ZORBAX 300SB-C8為美國 Agilent 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人 β 干擾素與組氨酸標簽融合蛋白重組表達菌株的構(gòu)建 PCR 擴增、DNA 電泳及片段回收、大腸桿菌質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒酶切和連接等DNA 基本操作參見分子克隆操作指南[5]。提取人Bel-7402 細胞總 DNA 作為PCR 擴增的模板，設(shè)計一對引物（5’ TCCATATGATGAGCTACAACTTG CTTGG 3’ 和 5’ CGGGATCCTTAGTTTCGGAGGT AACCTGTAAG 3’），采用Pfu高保真 DNA 聚合酶進行 PCR 擴增。為確證 PCR 擴增得到的片段為正確的相關(guān)基因，將 PCR 產(chǎn)物電泳后進行膠回收純化，3’ 端加 A，克隆到 pGEM-T 載體上，得到重組質(zhì)粒 pGEM-IFNβ。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coliTG1 感受態(tài)細胞，挑取白斑，提取其中的重組質(zhì)粒進行NdeI 和BamHI 雙酶切鑒定。鑒定正確后，瓊脂糖凝膠電泳回收NdeI 和BamHI 雙酶切片段和同樣經(jīng)過上述酶切回收的載體 pET-16b 進行連接，轉(zhuǎn)化E.coliTG1，在含有 Amp 100 μg/ml的 LB 瓊脂平板上挑選轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒進行酶切鑒定，鑒定正確的重組表達質(zhì)粒命名為pET16b-IFNβ。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，獲得重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ。

1.2.2 組氨酸標簽人 β 干擾素在大腸桿菌中表達條件的摸索 為了使重組蛋白在細胞裂解液上清中表達量最大化，本工作進一步優(yōu)化了重組菌株表達的 IPTG 誘導(dǎo)時間、濃度和溫度。將菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 接種于 5 ml LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，取 1 ml上述菌液，轉(zhuǎn)種50 ml LB 培養(yǎng)基 37℃培養(yǎng)，待菌液 OD600約為0.6～1.0 時，以不同濃度的 IPTG 誘導(dǎo) 8 h，取1 ml 菌液收集菌體，進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。取上述 OD600約為0.6～1.0 時的菌液，在 0.08mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下37℃分別培養(yǎng) 1、2、3、5、6、7、8 h，取 1 ml 菌液收集菌體，進行 SDS-PAGE 分析。取上述 OD600約為0.6～1.0 時的菌液，在 0.08mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下分別在 37℃和 28℃培養(yǎng) 6 h，取1 ml 菌液收集菌體，破碎細胞，分別取上清、沉淀進行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3 Western blotting 分析 取菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 發(fā)酵液，收集菌體，破碎細胞，取上清進行 SDS-PAGE 后，取出凝膠放置于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，用 Bio-Rad semi-dry transfer轉(zhuǎn)膜儀進行蛋白印跡轉(zhuǎn)移，根據(jù)凝膠面積按0.65 mA/cm2電轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜用麗春紅 S 溶液浸泡 5min，再用水漂洗脫色，以確認目標條帶是否成功轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。然后將膜放入雜交袋，加入含 5%脫脂牛奶的 TBS，4℃封閉過夜。棄封閉液，加入用 5%脫脂牛奶稀釋（1∶1000）的一抗（人 β 干擾素抗體或抗His-tag 抗體），室溫緩慢振蕩 2 h。棄抗體，將膜以 TBS 漂洗 3 次，每次 5min，加入用 5%脫脂牛奶稀釋（1∶1000）的堿性磷酸酶標記的馬抗小鼠 IgG(H+L) 作為二抗，室溫緩慢振蕩 2 h。將膜放于 TBS 液中漂洗 3 次，每次 5min 后，膜置于堿性磷酸酶顯色底物 NBT/BCIP 溶液中，室溫顯色至特異性雜交條帶出現(xiàn)，將膜取出放置于去離子水中終止顯色。

1.2.4 組氨酸標簽人 β 干擾素純化 重組表達菌株在最適條件下進行培養(yǎng)，收集菌體，菌體用binding buffer 懸浮，置于冰浴中進行超聲破碎，直至無明顯菌體。10 000×g離心 10min，收集上清，0.45 μm 濾膜過濾備用。采用 ?KTA Explorer 系統(tǒng)，將過濾后的樣品上樣至以 5 倍體積 binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.01 mol/L 咪唑，pH 8.0）平衡的 His Trap FF crude親和柱，以 elution buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.25 mol/L 咪唑，pH 8.0）進行梯度洗脫，UV 280 nm 檢測收集目的蛋白峰。將含有目的蛋白的洗脫液合并，充分透析后冷凍干燥存儲。

1.2.5 高效液相分析重組蛋白純度 將純化的重組蛋白樣品進行 HPLC 分析，采用島津SHIMADZU-20A 儀器，C8 反相柱，流動相 A：20%乙腈，流動相 B：0.1%三氟乙酸（TFA），連續(xù)梯度洗脫，在 30min內(nèi)乙腈濃度由 20%增至80%，流速為1 ml/min。記錄產(chǎn)物峰面積，并計算表達產(chǎn)物的純度。

1.2.6 人 β 干擾素生物學活性測定 參照 2005年版《中國藥典》第三部附錄中干擾素生物學活性測定法，依據(jù)細胞病變抑制法，將培養(yǎng)于含 10%小牛血清的 MEM 培養(yǎng)基中的 Wish 細胞生長24～48 h 時配成細胞濃度約為3×105個/ ml 的懸液，加到 96 孔細胞培養(yǎng)板上，每孔 100 μl。同時設(shè)立標準品對照。在含 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng) 4～6 h 后，每孔加入 4 倍系列稀釋的干擾素樣品 100 μl，樣品稀釋用含 7%小牛血清的 MEM培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng) 18～24 h。棄上清后用含 3%小牛血清 MEM 培養(yǎng)基稀釋 VSV 至 100 TCID50進行攻擊，然后于含 5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)24 h 左右。棄掉培養(yǎng)板中的上清液，每孔加入 50 μl的結(jié)晶紫液室溫染色 30min，棄掉染液，用自來水沖洗殘余的染液，用濾紙吸干后每孔加入 100 μl的脫色液脫色，在 Bio-Rad 自動酶標儀上于570 nm 波長處測定每孔的吸收值（OD），記錄測定結(jié)果，將數(shù)據(jù)結(jié)果按照四參數(shù)回歸計算法進行處理，以標準品為參考，并根據(jù)下列公式計算待測樣品活性。

2 結(jié)果

2.1 人 β 干擾素與組氨酸標簽融合蛋白重組表達載體的構(gòu)建及表達菌株的獲得

人 β 干擾素的編碼序列存在于一個外顯子上，提取人 Bel-7402 細胞總 DNA 作為PCR 擴增的模板進行擴增，得到預(yù)期大小的 PCR 產(chǎn)物（圖1A）。PCR 產(chǎn)物進行序列測定，測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進行 Blast 比對和分析，表明獲得的片段序列與已知人 β 干擾素的基因序列完全一致。本工作采用質(zhì)粒 pET-16b 作為表達載體，將人 β 干擾素基因克隆至載體組氨酸標簽編碼序列之后，可表達組氨酸標簽與人 β 干擾素的融合蛋白。將人 β 干擾素基因片段克隆至載體 pET-16b，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進行酶切鑒定，獲得與 PCR 擴增的基因大小一致的片段（圖1B），表明人 β 干擾素基因成功插入了 pET-16b 質(zhì)粒。將獲得的重組表達質(zhì)粒命名為pET16b-IFNβ。將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3) 感受態(tài)細胞，獲得重組表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ。

圖1 IFNβ 的 PCR 擴增和 pET16b-IFNβ 的酶切驗證Figure 1 PCR product of IFNβ and restriction enzymatic analysis of pET16b-IFNβ

2.2 組氨酸標簽人 β 干擾素的表達

2.2.1 組氨酸標簽人 β 干擾素表達的 IPTG 誘導(dǎo)濃度、時間和溫度的摸索 以不同濃度的 IPTG誘導(dǎo) 8 h，SDS-PAGE 結(jié)果表明在 0.08mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下表達量最高，增加 IPTG 誘導(dǎo)濃度表達量無明顯增加（圖2A）。在 0.08mmol/L IPTG 誘導(dǎo)條件下分別誘導(dǎo)不同時間，SDS-PAGE結(jié)果表明誘導(dǎo) 6 h 后，表達量已經(jīng)達最大，以后沒有明顯增加（圖2B）。分別在 37℃和 28℃培養(yǎng)下進行誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE 結(jié)果表明在 28℃培養(yǎng)下，表達產(chǎn)物存在于細胞裂解液上清中更多（圖2C）。最終確定最優(yōu)表達條件為，0.08mmol/L IPTG 誘導(dǎo)下，28℃培養(yǎng) 6 h。

2.2.2 Western blotting 檢測 表達的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白分子量約為20 kD，N-端帶有His-tag，分別用抗His-tag 抗體和人 β 干擾素特異性抗體進行 Western blotting 檢測。在約 20 kD 處有一明顯雜交條帶（圖3），表明該特異條帶為組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白。

2.3 組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白的純化

將組氨酸標簽人 β 干擾素表達菌株E.coliBL21(DE3)/pET16b-IFNβ 在最適條件下發(fā)酵，采用HisTrap FF crude 親和柱純化，收集目的蛋白，梯度透析，冷干。每升發(fā)酵液可獲得 28.2 mg 純化后的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白（圖4）。將純化的蛋白樣品進行 HPLC 分析，檢測其純度，結(jié)果顯示組氨酸標簽人 β 干擾素的保留時間為11.5min，純度為92%（圖5）。

圖2 HIS-IFNβ 在大腸桿菌 BL21(DE3) 中的表達Figure 2 The expression of HIS-IFNβ in E.coli BL21(DE3)

圖3 Western blotting檢測HIS-IFNβ的表達Figure 3 Western blotting analysis of the expression of HIS-IFNβ

圖4 HIS-IFNβ 蛋白的純化Figure 4 Purification of HIS-IFNβ

圖5 HPLC 檢測 HIS-IFNβ 的純度Figure 5 HPLC analysis of purified HIS-IFNβ

2.4 組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白生物學活性測定

參照 2005年版《中國藥典》第三部附錄中干擾素生物學活性測定法，結(jié)果經(jīng)干擾素 β 國家標準品（2008 國生標字 0015）校正，確定其比活性為4.2×107U/mg。

3 討論

作為科研用的細胞因子試劑，其應(yīng)用領(lǐng)域主要為生命科學領(lǐng)域的遺傳學、發(fā)育學、細胞學、免疫學、生物化學和分子生物學，基礎(chǔ)醫(yī)學與藥學等，并包括了相應(yīng)的應(yīng)用性開發(fā)研究。為了增加科研用細胞因子試劑的示蹤性、可檢測性及其穩(wěn)定性，進一步完善、拓展科研用細胞因子試劑的特性，擴展其用途，使其逐步向高端產(chǎn)品方向邁進，我們進行了標簽化細胞因子（tag-細胞因子）試劑的研制，現(xiàn)已表達了多種標簽化的細胞因子。標簽化細胞因子不僅可方便細胞因子試劑本身的分離純化，利用此功能，還可方便地進一步分離和研究其受體或與其相互作用的分子，可提高基礎(chǔ)研究的效率和水平。同時，不僅其本身能作為普通的科研用細胞因子試劑，而且可作為研發(fā)臨床診斷試劑的重要的中間核心物質(zhì)，具有潛在的診斷試劑特性。

本工作采用大腸桿菌表達系統(tǒng)中常用的E.coliBL21(DE3)，該宿主是以 T7 RNA 聚合酶為表達系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達宿主。載體 pET-16b在大腸桿菌中可以快速而有效地表達重組蛋白，它利用 T7 啟動子和終止子進行高效表達，并可在表達蛋白 N 端加上組氨酸標簽，便于表達產(chǎn)物的純化。而且在組氨酸標簽后加上凝血酶 Xa 的酶切位點，便于純化產(chǎn)物后將組氨酸標簽切除，利于產(chǎn)物的后續(xù)處理。本工作結(jié)果表明在此系統(tǒng)中可成功表達帶有組氨酸標簽的人 β 干擾素，每升發(fā)酵液可獲得 28.2 mg 純化后的組氨酸標簽人 β 干擾素蛋白。表達的融合蛋白既能與組氨酸標簽抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)，又可與人 β 干擾素抗體產(chǎn)生結(jié)合反應(yīng)。利用 Ni sepharose 親和層析純化，從大腸桿菌的上清中分離得到純度 92%的細胞因子。干擾素生物學活性測定也表明，獲得的組氨酸標簽的人 β 干擾素具有人 β 干擾素生物學活性，比活性為4.2×107U/mg。本工作為進一步以此系統(tǒng)表達其他科研用標簽化的細胞因子奠定了基礎(chǔ)。

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