肖順應(yīng) 葉元土蔡春芳 金素雅 朱 磊 姚仕彬 姚林杰

(蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州 215123)

飼料磷在魚(yú)體形體上主要表現(xiàn)在對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響，如出現(xiàn)骨骼鈣化不全、骨骼形變以及脊椎側(cè)彎、鰓蓋殘缺等現(xiàn)象。Uyan等［1］研究發(fā)現(xiàn)，在給牙鲆飼喂低磷飼料后，試驗(yàn)前期鰓蓋及骨組織的微結(jié)構(gòu)已經(jīng)發(fā)生變化。Sugiura等［2］和Baeverfjord等［3］在試驗(yàn)中也觀察到了磷缺乏導(dǎo)致的由鰓蓋畸變到骨骼形變的過(guò)程。本試驗(yàn)擬在純化飼料中添加不同濃度的磷酸二氫鈣，旨在研究飼料磷水平對(duì)草魚(yú)形體的影響，并對(duì)魚(yú)體的骨骼畸形狀況進(jìn)行判定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

草魚(yú)(Ctenopharyngodon idellus)幼魚(yú)由江蘇省蘇州市相城區(qū)特種水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)提供，磷酸二氫鈣由無(wú)錫華諾威動(dòng)物保健品有限公司提供，酪蛋白、糊精、明膠、羧甲基纖維素鈉、微晶纖維素、無(wú)水氯化鈣購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，玉米淀粉購(gòu)于江蘇省蘇州市蓮花五區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.2 試驗(yàn)飼料

根據(jù)草魚(yú)的配合飼料營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 1024—1997)設(shè)計(jì)配方，在以酪蛋白、豆油、淀粉、糊精和纖維素為原料的純化飼料中分別添加0、13、29、45、61、77 g/kg磷酸二氫鈣，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。飼料原料經(jīng)粉碎過(guò)60目篩，混合均勻，用小型面條加工機(jī)加工成1.5 mm粗細(xì)的條狀料，電風(fēng)扇條件下干燥后再手工搓碎，篩選3～4 mm長(zhǎng)的顆粒飼料置于冰箱中4℃密封保存。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)草魚(yú)初始平均體重為22.29 g，為池塘養(yǎng)殖的1冬齡魚(yú)種。試驗(yàn)魚(yú)經(jīng)1周暫養(yǎng)、馴化后，選擇體格健壯、規(guī)格整齊的魚(yú)種270尾，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)放魚(yú)15尾，分別投喂飼料Ⅰ～Ⅵ。正式養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)75 d。

養(yǎng)殖設(shè)施為室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)，單缸直徑70 cm，養(yǎng)殖容積0.23 m3，以曝氣自來(lái)水為水源，使用間歇性控電開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)水體，每進(jìn)水20 min關(guān)閉40 min，反復(fù)循環(huán)，缸內(nèi)出水直接排走。定期使用水博士水質(zhì)測(cè)定盒測(cè)量水質(zhì)。養(yǎng)殖期間水質(zhì)條件為:水溫20～26℃、溶解氧含量在6.0 mg/L以上、pH 7.0 ～7.4、氨氮含量 0.20 ～0.40 mg/L、亞硝酸鹽氮含量0.05～0.10 mg/L。試驗(yàn)飼料于每天08:00、12:00、17:30各投喂1次，投喂量為各試驗(yàn)組魚(yú)體體重的2%～3%。

表1 試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(DM basis) g/kg

1.4 樣品采集與分析

養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始前，取10尾草魚(yú)測(cè)定魚(yú)體體重、體長(zhǎng)、吻－鰓蓋長(zhǎng)。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，從每個(gè)養(yǎng)殖缸中隨機(jī)取8尾魚(yú)測(cè)定魚(yú)體體重、體長(zhǎng)、吻－鰓蓋長(zhǎng)，計(jì)算體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率、吻－鰓蓋長(zhǎng)/體長(zhǎng)(吻端至鰓蓋末端長(zhǎng)與體長(zhǎng)的比值)以及肥滿度;每組隨機(jī)取魚(yú)3尾用X光機(jī)進(jìn)行魚(yú)體骨骼的觀察。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)組間差異，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)草魚(yú)體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率的影響

由表2可知，草魚(yú)體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率最高的是Ⅲ組，達(dá)到 0.65%/d，顯著高于Ⅰ、Ⅱ組(P ＜0.05);最低的是Ⅰ組，為0.34%/d，顯著低于除Ⅱ組外的其他試驗(yàn)組(P＜0.05);其余各試驗(yàn)組間沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明當(dāng)飼料磷酸二氫鈣水平低于29 g/kg時(shí)，體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率隨飼料磷水平的增加而升高，當(dāng)磷酸二氫鈣水平高于45 g/kg時(shí)，體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率保持比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

表2 各試驗(yàn)組草魚(yú)的體長(zhǎng)特定生長(zhǎng)率、吻－鰓蓋長(zhǎng)/體長(zhǎng)和肥滿度Table 2 The specific growth rate of length，snout-gill cover length/body length and condition factor of grass carp in different experimental groups

2.2 對(duì)草魚(yú)肥滿度的影響

由表2可知，飼料磷水平對(duì)草魚(yú)的肥滿度沒(méi)有顯著影響(P＞0.05)，但以Ⅲ組的肥滿度最高，為2.00%。這說(shuō)明當(dāng)飼料中磷酸二氫鈣的水平為29 g/kg時(shí)，草魚(yú)能獲得較高的肥滿度。

2.3 對(duì)吻－鰓蓋長(zhǎng)/體長(zhǎng)的影響

由表2可知，各試驗(yàn)組草魚(yú)的吻－鰓蓋長(zhǎng)/體長(zhǎng)沒(méi)有顯著差異(P ＞0.05)，均在 0.26 ～0.28 范圍內(nèi)。這說(shuō)明飼料磷水平對(duì)草魚(yú)鰓蓋骨的發(fā)育沒(méi)有造成顯著的影響，沒(méi)有出現(xiàn)因磷的缺乏或者過(guò)量而導(dǎo)致的鰓蓋骨畸形情況。

2.4 對(duì)草魚(yú)畸形程度的影響

在養(yǎng)殖的過(guò)程中，試驗(yàn)魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)諸如出血等體表受傷的病狀。養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，肉眼觀察可發(fā)現(xiàn)部分魚(yú)的骨骼出現(xiàn)了畸形，畸形的主要部位在魚(yú)的尾柄。各試驗(yàn)組草魚(yú)在X射線照射下的骨骼狀況見(jiàn)圖1。

由X射線照射結(jié)果可知，飼料中磷水平對(duì)6個(gè)試驗(yàn)組的草魚(yú)頭骨沒(méi)有明顯的影響，肉眼不能觀察到頭骨出現(xiàn)畸形的狀況。飼料磷水平對(duì)草魚(yú)脊椎骨有明顯的影響，主要表現(xiàn)為引起了草魚(yú)脊椎骨的變形，發(fā)生脊椎骨彎曲的部位約在脊椎骨末端1/5處。由X線片及采樣時(shí)的觀察可知:Ⅰ組草魚(yú)的脊椎骨在肉眼和X射線下觀察都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的畸形情況(圖1－Ⅰ);Ⅱ和Ⅲ組草魚(yú)的脊椎骨在肉眼觀察時(shí)基本沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的畸形情況，但是在X射線下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)部分魚(yú)的脊椎骨已經(jīng)有了一定的畸形情況(圖1－Ⅱ和圖1－Ⅲ);Ⅳ組草魚(yú)的脊椎骨在肉眼觀察時(shí)可見(jiàn)部分魚(yú)的尾部稍微有些上翹，在X射線下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)部分魚(yú)的脊椎骨已經(jīng)有了一定的畸形情況(圖1－Ⅳ);Ⅴ和Ⅵ組草魚(yú)的脊椎骨在肉眼觀察時(shí)就能發(fā)現(xiàn)一些草魚(yú)尾部上翹，尤其是Ⅵ組草魚(yú)尾部已經(jīng)嚴(yán)重彎曲上翹，在X射線下觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)尾部脊椎骨也有了畸形的情況(圖1－Ⅴ和圖1－Ⅵ)。由此可以判斷:Ⅰ組草魚(yú)沒(méi)有出現(xiàn)畸形或者畸形的程度不嚴(yán)重，肉眼還不能準(zhǔn)確判斷;Ⅱ和Ⅲ組草魚(yú)已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)輕微的畸形，因?yàn)榛蔚某潭炔粐?yán)重，所以只能在X射線條件下觀察到脊椎骨的畸形而不能肉眼識(shí)別體形的不正常，畸形的程度只視為輕度畸形;Ⅳ組草魚(yú)已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)畸形，肉眼能識(shí)別出體形的不正常，在X射線條件下可觀察到脊椎骨的畸形，畸形的程度可視為中度畸形;Ⅴ和Ⅵ組草魚(yú)出現(xiàn)的畸形情況比較嚴(yán)重，不只是脊椎骨出現(xiàn)明顯的畸形情況，就連魚(yú)體的外表形態(tài)也發(fā)生明顯的畸形變化，并可通過(guò)肉眼觀察判斷，可視為重度畸形。

3 討論

魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，魚(yú)體會(huì)發(fā)生一系列結(jié)構(gòu)和功能上的變化。魚(yú)類(lèi)在發(fā)育的過(guò)程中容易出現(xiàn)骨骼的非健康狀態(tài)，骨骼的發(fā)育畸形包括脊柱側(cè)凸、脊柱前彎、鰓蓋彎曲、尾椎畸形和頜畸形等，同時(shí)，出現(xiàn)畸形的魚(yú)往往生長(zhǎng)緩慢、抗病能力弱［4］。影響魚(yú)類(lèi)骨骼發(fā)育的因素主要有飼料中鈣、磷、維生素及氨基酸含量以及脂肪的含量和種類(lèi)等。Geurden 等［5－6］研究報(bào)道，不同類(lèi)型的磷脂對(duì)鯉魚(yú)的生長(zhǎng)和發(fā)育有不同的影響，卵磷脂具有促生長(zhǎng)的作用，而肌醇酸磷脂則能顯著降低骨骼畸形。陳彥等［7］的研究表明，磷脂及其代謝產(chǎn)物能提高作為生物膜Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)重要組成部分的Ca2+-ATP酶的活性，Ca2+-ATP酶不僅參與骨組織有機(jī)質(zhì)的鈣化，還直接參與成骨細(xì)胞向骨組織的分化，是決定骨骼正常發(fā)育的重要因素。Gapasin等［8］研究報(bào)道，投喂添加高不飽和脂肪酸的飼料能顯著降低比目魚(yú)的鰓蓋畸形率，其鰓蓋畸形率由未添加時(shí)的27.3% ～33.5%降低到了添加后的15.8% ～23.5% 。Gapasin［9］報(bào)道，二十二碳六烯酸(DHA)和維生素C都能影響比目魚(yú)骨骼的發(fā)育，投喂添加DHA的飼料后比目魚(yú)的畸形率由33%降低到了17%，而投喂添加DHA和維生素C飼料后比目魚(yú)的畸形率只有8.4% ～13.7%。Dedi等［10］報(bào)道，在日本比目魚(yú)飼料中添加高劑量的維生素A后，比目魚(yú)的生長(zhǎng)速度降低，出現(xiàn)脊柱彎曲、椎骨縮短等骨骼畸形情況。Takeuchi等［11］在比目魚(yú)飼料(車(chē)輪蟲(chóng))中添加幾種維生素A后，比目魚(yú)出現(xiàn)了嚴(yán)重的骨骼畸形。Dabrowski［12］研究報(bào)道，鯉魚(yú)飼料中缺乏維生素C時(shí)會(huì)出現(xiàn)脊柱側(cè)凸、鰓絲扭曲、鰓蓋變短等畸形的癥狀。Dabrowski等［13］研究表明，維生素C缺乏會(huì)引起鯉魚(yú)幼苗鰓弓變形和尾鰭腐爛。Hilomen-Garcia［14］報(bào)道，當(dāng)飼料中維生素C缺乏時(shí)，會(huì)影響比目魚(yú)鰓蓋的發(fā)育，從而導(dǎo)致比目魚(yú)的鰓蓋膜裂開(kāi)。Akiyama等［15］報(bào)道，色氨酸缺乏將會(huì)引起紅馬哈魚(yú)、虹鱒魚(yú)、大馬哈魚(yú)和銀大馬哈魚(yú)的脊柱側(cè)凸，色氨酸能有效治愈大馬哈魚(yú)的骨骼畸形。

圖1 各試驗(yàn)組草魚(yú)的X線片F(xiàn)ig.1 X-ray film of grass carp in different experimental groups

在已有的文獻(xiàn)中，研究的主要方向都是營(yíng)養(yǎng)素對(duì)魚(yú)類(lèi)骨骼發(fā)育的影響，一系列營(yíng)養(yǎng)素的缺乏或過(guò)量可能會(huì)引起骨骼系統(tǒng)的畸形，尤其是脊椎骨的畸形;而對(duì)于魚(yú)體畸形的判定主要是通過(guò)肉眼的觀察，看其與正常魚(yú)體的形態(tài)特征是否有差別來(lái)加以判斷。在本試驗(yàn)中出現(xiàn)了肉眼觀察魚(yú)體體形正常，但在X射線條件下觀察魚(yú)體脊椎骨已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度畸形的現(xiàn)象。因此，對(duì)魚(yú)體畸形情況的判定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)科研試驗(yàn)的進(jìn)行具有很大的指導(dǎo)意義。本文把魚(yú)類(lèi)的骨骼畸形程度作以下的區(qū)別。

健康魚(yú)體:通過(guò)肉眼觀察魚(yú)體體形正常，在X射線或其他方式條件下直接觀察脊椎骨形態(tài)正常的魚(yú)體為健康魚(yú)體。

輕度畸形:通過(guò)肉眼觀察魚(yú)體體形正常，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨在某一點(diǎn)開(kāi)始偏離脊椎骨主軸，但魚(yú)體體形仍基本保持正常，與主軸之間形成一定的角度，當(dāng)角度低于時(shí)20.0°時(shí)，認(rèn)為該尾魚(yú)為輕度畸形，如圖2－A所示。

中度畸形:通過(guò)肉眼可觀察到魚(yú)體的尾柄已經(jīng)出現(xiàn)了一定程度的畸形，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨在某一點(diǎn)開(kāi)始偏離脊椎骨主軸，并與主軸之間形成一定的角度，角度大小在 20.0°～45.0°時(shí)，認(rèn)為該尾魚(yú)為中度畸形，如圖2－B所示。

重度畸形:通過(guò)肉眼可觀察到魚(yú)體體形已經(jīng)出現(xiàn)了嚴(yán)重的畸形，在X射線或其他方式條件下可直接觀察到脊椎骨某點(diǎn)偏離主軸角度大于45.0°，或者出現(xiàn)不止一次的偏離主軸時(shí)，認(rèn)為該尾魚(yú)為重度畸形，如圖2－C所示。

圖2 草魚(yú)骨骼畸形圖示Fig.2 Graphical representation of grass carp bone deformity

在本試驗(yàn)中，Ⅰ組草魚(yú)形體健康，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)畸形情況;Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ組草魚(yú)出現(xiàn)了輕度或者中度畸形的情況;Ⅴ和Ⅵ組草魚(yú)出現(xiàn)了重度畸形情況。在形態(tài)學(xué)上，魚(yú)類(lèi)的骨骼包括頭部膜骨、體內(nèi)骨骼和鱗片。在本試驗(yàn)中，從形態(tài)學(xué)觀察來(lái)看，養(yǎng)殖結(jié)束后魚(yú)體的頭骨、鰓蓋骨及鱗片沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象，但是飼料含磷量高的組出現(xiàn)了尾柄畸形的情況，從X射線下觀察脊椎骨可知高磷組草魚(yú)的畸形情況比較嚴(yán)重，而低磷組草魚(yú)脊椎骨反而正常，這與眾多研究中認(rèn)為飼料中磷含量偏低會(huì)引起魚(yú)體骨骼畸形的觀點(diǎn)相悖。這可能是因?yàn)?，在養(yǎng)殖過(guò)程中，低磷組草魚(yú)的攝食率偏低，攝入的磷酸二氫鈣含量低于高磷組草魚(yú)，又由于純化飼料的適口性較差，硬度較大，不利于魚(yú)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，從而阻礙了魚(yú)體的生長(zhǎng)，因此低磷組草魚(yú)的生長(zhǎng)性能不好，畸形情況沒(méi)有體現(xiàn)出來(lái)，而高磷組草魚(yú)攝入了過(guò)量的磷酸二氫鈣，從而導(dǎo)致了魚(yú)體的畸形。

4 結(jié)論

①本試驗(yàn)條件下，飼料中磷酸二氫鈣添加過(guò)量(超過(guò)29 g/kg)時(shí)容易影響草魚(yú)形體發(fā)育，導(dǎo)致魚(yú)體骨骼的畸形。

②按魚(yú)體的脊椎骨畸形情況可以把草魚(yú)形體分為4個(gè)等級(jí)(健康魚(yú)體、輕度畸形、中度畸形和重度畸形)，魚(yú)體脊椎骨的畸形情況可作為飼料磷水平的一個(gè)判斷標(biāo)準(zhǔn)。

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