李 君，羅 軍，許會(huì)芬，胡仕良

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100）

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（E26 transformation-specific，Ets）通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增生［1］、分化、凋亡及細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要作用［2］。Ets轉(zhuǎn)錄因子受多種信號(hào)通路的調(diào)控，如MAP激酶（ERK，p38和 JAK）［3］、Ca2+依賴的信號(hào)通路、TGF-β 和 JAK/STAT 信號(hào)通路等［4］。研究發(fā)現(xiàn)，眾多參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的蛋白酶類、細(xì)胞因子的啟動(dòng)子序列中都含有Ets-1的結(jié)合位點(diǎn)［5］。山羊泌乳過程中脂肪酸代謝受到眾多基因的調(diào)節(jié)，這些基因的表達(dá)調(diào)控常常受到多種信號(hào)通路以及細(xì)胞因子的調(diào)控。研究表明，Ets-1基因能通過調(diào)控一些細(xì)胞因子影響細(xì)胞脂肪酸代謝。本研究旨在克隆西農(nóng)薩能羊Ets-1基因的cDNA，為進(jìn)一步研究該基因在山羊泌乳過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集處于泌乳末期的西農(nóng)薩能羊乳腺組織2 g左右，用DEPC滅菌水洗凈樣品表面殘留的血液及雜質(zhì)，迅速投入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 DEPC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Trizol和5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Version 2.0購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；3’-Full RACE Core Set Version 2.0、LA Taq DNA 聚合酶、10×LA Buffer II、dNTPs及pMD19-T載體等購(gòu)自大連寶生物工程有限公司（TaKaRa）；DNA片段快速回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；TOP10感受態(tài)細(xì)胞、DNA Marker DL2000、MarkerⅢ及普通質(zhì)粒提取試劑盒等均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 通過對(duì)GenBank中牛（NM_001099106）、人（NM_005238）和小鼠（NM_011808）等物種的 Ets-1基因進(jìn)行同源性比對(duì)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），找出該基因在不同物種間的保守區(qū)域，利用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)特異性克隆引物（表1），包括：RT-PCR 引物 ES1和 EA1，5’RACE 引物 EGSP、E51、E52，3’RACE 引物 E31和 E32。

表1 山羊Ets-1基因cDNA克隆引物

1.2.2 RNA提取與cDNA合成 采用Trizol法提取總RNA，加入DNaseⅠ去除可能存在的基因組DNA，將所提取的總RNA進(jìn)行分裝，一部分于-80℃保存?zhèn)溆茫硪徊糠钟糜谧贤夥止夤舛葍x測(cè)定和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。按照TaKaRa公司PrimeScriptRT reagent Kit說明將檢測(cè)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Ets-1基因cDNA的克隆與測(cè)序 以西農(nóng)薩能羊泌乳末期的乳腺組織cDNA為模板，進(jìn)行CDS區(qū)的PCR擴(kuò)增。其反應(yīng)體系為：2 μL 10×LA Buffer II（含 Mg2+），2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），1 μL ES1（10 μmol/L），1 μL EA1（10 μmol/L），0.2 μL LA Taq DNA 聚合酶 （5 u/μL），50～100 ng模板，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4 min；94℃變性 30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸 1 min 20 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保溫。取 5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

根據(jù) Invitrogen 的 5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends操作說明進(jìn)行5’UTR的擴(kuò)增，選用EGSP、E51 和 E52；根據(jù) TaKaRa的 3’-Full RACE Core Set操作說明進(jìn)行3’UTR的擴(kuò)增，選用引物E31和E32。方法見各自操作說明，退火溫度見表1。

將所有擴(kuò)增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，用DNA快速回收試劑盒回收目的片段，與pMD19-T載體于16℃連接過夜；次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TOP 10感受態(tài)細(xì)胞，復(fù)蘇后涂布于含有 24 μg/mL X-gal，20 μg/mL IPTG及100 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)皿表面，37℃培養(yǎng)12～16 h；挑取單個(gè)白色陽性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取和酶切鑒定，將含陽性重組質(zhì)粒的菌液送于Invitrogen上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列分析 利用NCBI中的blastn和blastp（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）對(duì)測(cè)序得到的Ets-1基因序列進(jìn)行同源性分析；通過BioXM 2.6軟件對(duì)Ets-1的氨基酸序列進(jìn)行物種間多序列比對(duì)；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtScale程序?qū)Π被嵝蛄凶魇杷苑治觯╤ttp：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）和Protparam對(duì)蛋白質(zhì)的分子量及等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）；通過CBS Prediction Servers中的 TMH MM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、SignalP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 和 CPHmodels（http：//www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/）分別對(duì) Ets-1的跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽區(qū)域和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊Ets-1基因cDNA的克隆 以山羊乳腺總RNA為模板，通過RT-PCR和RACE技術(shù)克隆得到山羊Ets-1基因cDNA全長(zhǎng)2 263 bp（GenBank收錄號(hào)為HQ589338）。經(jīng)序列分析表明：山羊Ets-1基因的CDS區(qū)全長(zhǎng)1 326 bp（圖1A），編碼441個(gè)氨基酸殘基，其起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA；Ets-1基因的5’UTR為 331 bp（圖 1B）；3’UTR 為 606 bp（圖 1C），包括完整的poly（A）尾巴。

圖1 Ets-1基因克隆產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

2.2 山羊Ets-1的同源性分析 經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊Ets-1基因與其他物種相似性較高，其ORF與GenBank中牛（NM_001099106）、豬（NM_001162886）、人（NM_005238）和小鼠（NM_011808）的Ets-1基因相比較，核苷酸相似性分別為98%、94%、92%和90%，氨基酸的相似性分別為98%、98%、98%和96%（圖2）。其非翻譯區(qū)核苷酸與牛、豬、人和小鼠的相應(yīng)序列相比較，5＇UTR相似性分別為98%、85%、82%和 71%，3＇UTR 與牛、豬、人和小鼠相似性分別為96%、83%、81%和77%。

圖2 山羊、牛、人、小鼠、豬Ets-1基因氨基酸序列比對(duì)結(jié)果

2.3 山羊Ets-1的結(jié)構(gòu)分析 經(jīng)SignalP預(yù)測(cè)分析，山羊Ets-1不存在信號(hào)肽序列（圖略）；經(jīng)TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)，屬于膜外蛋白（圖略）；蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測(cè)分析（圖3）表明，Ets-1的N-端和C-端均存在明顯的親水性區(qū)域（Score＞1.5），其中376—384AA殘基具有較強(qiáng)的親水性（Score＞2）；蛋白質(zhì)的分子量及等電點(diǎn)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ets-1的蛋白質(zhì)分子量為50 340.8D，理論等電點(diǎn)為5.08。

利用CPH models 2.0軟件預(yù)測(cè)得到山羊Ets-1的蛋白結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ets-1具有典型的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，含有3個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊以H1-S1-S2-H2-H3-S3-S4方式排列。

圖3 山羊Ets-1的疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

3 討論

Ets家族是最大的信號(hào)依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族之一，在細(xì)胞、組織和器官水平，Ets家族轉(zhuǎn)錄因子參與多種哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞間相互作用。本研究首次克隆了西農(nóng)薩能羊Ets-1基因的cDNA序列，其全長(zhǎng)2 263 bp，編碼441個(gè)氨基酸。該基因的CDS區(qū)與其他哺乳動(dòng)物間存在高度同源性，與牛、小鼠、大鼠、豬和人的Ets-1基因相比，其核苷酸相似性在90%以上，氨基酸相似性在95%以上。山羊與牛5＇UTR的相似性為98%，3＇UTR的相似性為96%，該基因與其它物種非翻譯區(qū)（5＇UTR 和 3＇UTR）的相似性不高，并且存在較大差異。由于非翻譯區(qū)對(duì)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)控起到非常重要的作用，大多數(shù)調(diào)控序列也都集中于非翻譯區(qū)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)山羊Ets-1基因的非翻譯區(qū)進(jìn)行了克隆，為研究該基因的調(diào)控機(jī)制提供參考。

細(xì)胞對(duì)外界刺激的反應(yīng)由一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)所控制，它們將細(xì)胞外受體接受的信號(hào)傳遞到細(xì)胞核［6］。Ets家族轉(zhuǎn)錄因子就屬于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的細(xì)胞核效應(yīng)物，接受信號(hào)后控制基因的轉(zhuǎn)錄［7］。Ets家族既可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的上游效應(yīng)物，表達(dá)為多種生長(zhǎng)因子的受體；也可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游效應(yīng)物，其活性直接受磷酸化作用的控制，確定它們是激活還是抑制相應(yīng)的靶基因［8］。近年來的研究表明，Ets家族轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，Ets家族蛋白（如Ets-l和Ets-2）的過度表達(dá)，可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)細(xì)胞惡性變異，也可以誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生腫瘤［9-10］。在許多類型的人類腫瘤中都已發(fā)現(xiàn)Ets-1的過度表達(dá)［11］，且在乳腺癌、肺癌和腸癌中Ets-1的表達(dá)水平已成為評(píng)價(jià)腫瘤惡性度和預(yù)后的重要指標(biāo)。

目前關(guān)于Ets-1在腫瘤方面的研究廣泛，在其它方面研究甚少。但對(duì)關(guān)于激活Ets-1表達(dá)的信號(hào)通路、受Ets-1調(diào)控的靶基因了解不夠充分。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)羊乳腺Ets-1基因進(jìn)行克隆與分析，為轉(zhuǎn)錄因子Ets-1在山羊上的功能及調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

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