于農(nóng) 王建英 劉虹 張守強(qiáng) 王先芳 魏春華 溫明春 侯奇
呼吸道非特異性炎癥是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題,在過(guò)去的二十年中,COPD、哮喘等非特異性炎癥性疾病的發(fā)病率和死亡率有所提高,尤其是在西方國(guó)家[1,2]。在呼吸道非特異性炎癥患者和動(dòng)物模型中,抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE、氣道炎癥已得到廣泛研究。越來(lái)越多的證據(jù)提示,活化CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13在呼吸道非特異性炎癥的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[3,4]。
隨著對(duì)呼吸道非特異性炎癥機(jī)制認(rèn)識(shí)的提高,抗炎已成為治療哮喘的重要手段。皮質(zhì)類固醇是最重要的抗炎藥物,并且可以切實(shí)改善呼吸道非特異性炎癥患者的肺功能。由于全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇可以產(chǎn)生許多毒副作用,因而吸入皮質(zhì)類固醇治療哮喘已成為首選方法。這種方法對(duì)于大多數(shù)患者可以減輕炎癥和支氣管狹窄[5]。多數(shù)報(bào)道認(rèn)為這種吸入方法僅引起局部毒副作用,但也有人認(rèn)為可引起全身副反應(yīng)。這種治療可引起腎上腺功能抑制,骨代謝降低,特別是在兒童可引起生長(zhǎng)遲緩,兒童的發(fā)病率也在提高[6,7]。因而需要尋找新的方法來(lái)控制這種疾病,可以成為治療疾病的替代性方法[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在中國(guó)、日本和其他亞洲國(guó)家已應(yīng)用了許多世紀(jì)。中藥治療COPD、哮喘的西醫(yī)醫(yī)學(xué)機(jī)制尚不清楚,因而需要更多的研究來(lái)探討中藥和有效成分的效應(yīng)和作用機(jī)制。
Vam3是從山葡萄根(Vitis Amurensis Rupr.)提取的二苯乙烯低聚體類化合物[9]。山葡萄主要生長(zhǎng)在中國(guó)的中部和東北地區(qū),在民間用其根和莖治療炎癥性疾病。我們以往研究發(fā)現(xiàn),從山葡萄根提取的Vam系列化合物,如Vam3、Vam4和Vain21等均具有相似結(jié)構(gòu)和抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)用小鼠動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)中藥有效成分Vam3對(duì)免疫應(yīng)答的影響。我們發(fā)現(xiàn),中藥有效成分Vam3可以調(diào)節(jié)TH1/TH2應(yīng)答,有效控制與哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子,與地塞米松抑制TH1/TH2應(yīng)答不同的是,中藥有效成分Vam3主要抑制TH2應(yīng)答,不影響IgG2a和IFN-γ合成。
1.1 小鼠和藥物 雄性balb/c小鼠(6周齡)購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[5],伴清蛋白(CA)、刀豆素 A(ConA)、地塞米松和二硝基苯(DNP)結(jié)合的清蛋白購(gòu)自 Sigma公司。ELISA用抗體購(gòu)自Binding Site和PharMingen。抗DNP IgE、IgG2a、IgGI購(gòu)自 Accurate Scientific。
1.2 中藥有效成分Vam3的制備 中藥有效成分Vam3由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制備[10]。根據(jù)人和動(dòng)物的體表面積來(lái)計(jì)算動(dòng)物用藥量,20 g小鼠折人體的1/387[11],AKR小鼠按30 g計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中每只小鼠每次給藥1 ml,2次/d。
1.3 抗原致敏、發(fā)敏及治療 將200 μg的CA和2 mg的清蛋白溶解在0.3 ml的PBS中,給小鼠腹膜內(nèi)注射,共兩次,間隔一周,如圖1所示。第二次致敏7 d后,將小鼠麻醉,用含100 ug CA的0.05 mlPBS氣管內(nèi)用藥來(lái)發(fā)敏,在20 d和30 d時(shí)用2倍劑量進(jìn)行發(fā)敏試驗(yàn),方法同前[12]。初次發(fā)敏24 h后,胃內(nèi)給以中藥有效成分Vam31 ml進(jìn)行治療,2次/d,連續(xù)17 d(見(jiàn)圖1)。用25型計(jì)量鈍不銹鋼針進(jìn)行胃內(nèi)給藥。地塞米松治療組腹膜內(nèi)注射0.5 mg/(kg·d)地塞米松進(jìn)行治療。鹽水對(duì)照組每天腹膜內(nèi)給予鹽水進(jìn)行處理。未處理組同其他對(duì)照。
1.4 血清CA特異性抗體的測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組小鼠APTI測(cè)定結(jié)束后立即取血清并保存于-80℃。CA特異性IgE的測(cè)定用ELISA 方法[13]。
為了測(cè)定CA特異性IgG2a和IgG1,用CA包被酶標(biāo)板后進(jìn)行封閉和洗滌。樣品1∶50稀釋后加入酶標(biāo)板中4℃孵浴過(guò)夜。洗板后加入生物素化的大鼠抗小鼠IgG2a和IgG1的單抗,室溫孵浴45 min。加入親和素過(guò)氧化物酶(Sigma,1∶1000 稀釋),室溫置 15 min。洗板后,加入 2,2'-azine-bis,室溫置30 min,酶標(biāo)儀405nm處讀數(shù)。
由于沒(méi)有商業(yè)化小鼠抗CA抗體,小鼠CA抗原特異性IgE、IgG2a、IgG1的濃度計(jì)算參照測(cè)定小鼠抗 DNPIgE、IgG2a、IgG1時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡(jiǎn)單的講,DNP-清蛋白和CA以相同的濃度包被酶標(biāo)板,4℃過(guò)夜、洗板并封閉。小鼠抗DNP IgE、IgG2a、IgG1抗體依次1∶2稀釋10次,分別加入10個(gè)孔中。,起始濃度為1000ng/ml。其他步驟同上。所有實(shí)驗(yàn)均采用雙孔,變異率>10%則重復(fù)實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)的精確性。
1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞因子定量 每組實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞并懸于完全培養(yǎng)液中(RPMI1640中含10%的FBS,1%的青霉素和鏈霉素及1%的谷氨酰胺)。細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板培養(yǎng),每孔4×106/ml個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)液中含50 μg/ml的CA。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入ConA(2 μg/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照并設(shè)陰性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后收集上清。脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-4IL-5IL-13和IFN-γ水平的測(cè)定用ELISA方法,操作參照說(shuō)明書(shū)。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SigmaStat 2.03統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各治療組之間的差異由ANOVA決定。
2.1 中藥有效成分Vam3對(duì)抗原特異性抗體應(yīng)答的影響為了確定中藥有效成分Vam3治療對(duì)體液免疫應(yīng)答的影響,我們測(cè)定了血清CA特異性IgE和IgG2a的水平。如圖2所示,中藥有效成分Vam3治療組的IgE水平的顯著降低(P<0.01)。與鹽水處理組相比,IgG2a的水平略有升高,但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松治療組的IgE水平顯著降低(與鹽水處理組相比,P<0.01),但本組IgG2a的水平也顯著降低(與鹽水對(duì)照組相比,P <0.05)。
2.2 Vam3對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子應(yīng)答的影響 為了確定中藥有效成分Vam3對(duì)于T細(xì)胞應(yīng)答類型的影響,我們通過(guò)脾細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)評(píng)價(jià)Vam3和地塞米松對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。如圖3所示,抗原致敏、發(fā)敏的鹽水處理組比空白對(duì)照組的IL-4、IL-5、IL-13水平顯著顯著升高,而IFN-γ水平顯著降低,表明應(yīng)答為T(mén)H2占優(yōu)勢(shì)的應(yīng)答。然而與鹽水處理組相比,中藥有效成分Vam3組的IL-4分泌被完全阻斷,而IL-5和IL-13的水平下降近40%。有趣的是,中藥有效成分Vam3治療組CA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌量比鹽水處理組升高約27%,且ConA誘導(dǎo)的IFN-γ水平與空白對(duì)照組相同。地塞米松治療組則不同,無(wú)IL-4分泌,且IL-5和IL-13水平顯著降低,但CA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌被阻斷,且ConA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌比空白對(duì)照組顯著降低。
圖2 血清CA特異性抗體。(鹽水組,n=16;Vam3組,n=11,地塞米松組,n=12;空白對(duì)照組,n=14)進(jìn)行血清特異性抗體測(cè)定,用ELISA方法進(jìn)行。A:IgE水平B:IgG2a水平。數(shù)據(jù)均數(shù)±SEM由每組4-6只小鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。
圖3 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞分離后分別用含有CA(50 μg/ml)、ConA(2 μg/ml)和不含其他成分的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后收集上清。通過(guò)ELISA方法測(cè)定上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。結(jié)果為重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
患有變應(yīng)性疾病的人或動(dòng)物模型,當(dāng)再次接觸過(guò)敏原后,IgE可以通過(guò)使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒來(lái)介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)[14~17]。相反 IgG2a的產(chǎn)生則被認(rèn)為對(duì)機(jī)體有利[18]。以前的研究表明,一些抗炎的傳統(tǒng)中草藥方劑,如小青龍湯,可以抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的非特異性炎癥,表明可能對(duì)該類疾病具有治療作用[19]。Vam3 是從山葡萄根(Vitis Amurensis Rupr.)提取的二苯乙烯低聚體類化合物。研究表明,中藥有效成分Vam3治療后來(lái)可以顯著減少抗原特異性血清IgE的產(chǎn)生,IgG2a水平略有升高而IgG1水平下降。表明Vam3這種成分具有免疫調(diào)節(jié)作用,因而可能適于治療COPD、哮喘等呼吸道非特異炎癥性疾病。
正如Romagnani的綜述中所講[20],TH2型細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。IL-4/IL-13促進(jìn)B細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生IgE和粘液分泌增多,而IL-5對(duì)于嗜酸性粒細(xì)胞的富集、活化和生存起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn),與鹽水處理組相比,Vam3下調(diào)了IL-4、IL-5和IL-13的水平。這些結(jié)果表明,中藥有效成分Vam3抑制非特異性氣道炎癥與其下調(diào)TH2應(yīng)答有關(guān)。中藥有效成分Vam3可以抑制3種主要的TH2型細(xì)胞因子,因而可以提供比單用抗IL-4、IL-5和IL-13更全面的的治療方法。
在這個(gè)模型中,地塞米松也可以抑制氣道炎癥。然而與中藥有效成分Vam3不同的是,地塞米松雙向抑制了TH1(IFN-γ/IgG2a)和 TH2(IL-4、IL-5、IL-13 和 IgE)應(yīng)答。與鹽水處理組比較,中藥有效成分Vam3治療組的IFN-γ水平較高,但并不高于空白對(duì)照組。這種免疫調(diào)節(jié)劑可能比用TH1型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-12)和TH1型佐劑更加具有優(yōu)越性。因?yàn)樗粫?huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生比正常水平更高的TH1型細(xì)胞因子從而引起不必要的炎癥[21-23]。這些發(fā)現(xiàn)表明,中藥有效成分Vam3可能為臨床提供優(yōu)于糖皮質(zhì)激素的治療方法。
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