于農(nóng) 王建英 劉虹 張守強(qiáng) 王先芳 魏春華 溫明春 侯奇

呼吸道非特異性炎癥是世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，在過(guò)去的二十年中，COPD、哮喘等非特異性炎癥性疾病的發(fā)病率和死亡率有所提高，尤其是在西方國(guó)家[1，2]。在呼吸道非特異性炎癥患者和動(dòng)物模型中，抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生IgE、氣道炎癥已得到廣泛研究。越來(lái)越多的證據(jù)提示，活化CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的TH2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13在呼吸道非特異性炎癥的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用[3，4]。

隨著對(duì)呼吸道非特異性炎癥機(jī)制認(rèn)識(shí)的提高，抗炎已成為治療哮喘的重要手段。皮質(zhì)類固醇是最重要的抗炎藥物，并且可以切實(shí)改善呼吸道非特異性炎癥患者的肺功能。由于全身應(yīng)用皮質(zhì)類固醇可以產(chǎn)生許多毒副作用，因而吸入皮質(zhì)類固醇治療哮喘已成為首選方法。這種方法對(duì)于大多數(shù)患者可以減輕炎癥和支氣管狹窄[5]。多數(shù)報(bào)道認(rèn)為這種吸入方法僅引起局部毒副作用，但也有人認(rèn)為可引起全身副反應(yīng)。這種治療可引起腎上腺功能抑制，骨代謝降低，特別是在兒童可引起生長(zhǎng)遲緩，兒童的發(fā)病率也在提高[6，7]。因而需要尋找新的方法來(lái)控制這種疾病，可以成為治療疾病的替代性方法[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在中國(guó)、日本和其他亞洲國(guó)家已應(yīng)用了許多世紀(jì)。中藥治療COPD、哮喘的西醫(yī)醫(yī)學(xué)機(jī)制尚不清楚，因而需要更多的研究來(lái)探討中藥和有效成分的效應(yīng)和作用機(jī)制。

Vam3是從山葡萄根(Vitis Amurensis Rupr.)提取的二苯乙烯低聚體類化合物[9]。山葡萄主要生長(zhǎng)在中國(guó)的中部和東北地區(qū)，在民間用其根和莖治療炎癥性疾病。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，從山葡萄根提取的Vam系列化合物，如Vam3、Vam4和Vain21等均具有相似結(jié)構(gòu)和抗炎作用。本實(shí)驗(yàn)用小鼠動(dòng)物模型來(lái)評(píng)價(jià)中藥有效成分Vam3對(duì)免疫應(yīng)答的影響。我們發(fā)現(xiàn)，中藥有效成分Vam3可以調(diào)節(jié)TH1/TH2應(yīng)答，有效控制與哮喘相關(guān)的細(xì)胞因子，與地塞米松抑制TH1/TH2應(yīng)答不同的是，中藥有效成分Vam3主要抑制TH2應(yīng)答，不影響IgG2a和IFN-γ合成。

1 資料與方法

1.1 小鼠和藥物 雄性balb/c小鼠(6周齡)購(gòu)自濰坊醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[5]，伴清蛋白(CA)、刀豆素 A(ConA)、地塞米松和二硝基苯(DNP)結(jié)合的清蛋白購(gòu)自 Sigma公司。ELISA用抗體購(gòu)自Binding Site和PharMingen。抗DNP IgE、IgG2a、IgGI購(gòu)自 Accurate Scientific。

1.2 中藥有效成分Vam3的制備 中藥有效成分Vam3由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制備[10]。根據(jù)人和動(dòng)物的體表面積來(lái)計(jì)算動(dòng)物用藥量，20 g小鼠折人體的1/387[11]，AKR小鼠按30 g計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中每只小鼠每次給藥1 ml，2次/d。

1.3 抗原致敏、發(fā)敏及治療 將200 μg的CA和2 mg的清蛋白溶解在0.3 ml的PBS中，給小鼠腹膜內(nèi)注射，共兩次，間隔一周，如圖1所示。第二次致敏7 d后，將小鼠麻醉，用含100 ug CA的0.05 mlPBS氣管內(nèi)用藥來(lái)發(fā)敏，在20 d和30 d時(shí)用2倍劑量進(jìn)行發(fā)敏試驗(yàn)，方法同前[12]。初次發(fā)敏24 h后，胃內(nèi)給以中藥有效成分Vam31 ml進(jìn)行治療，2次/d，連續(xù)17 d(見(jiàn)圖1)。用25型計(jì)量鈍不銹鋼針進(jìn)行胃內(nèi)給藥。地塞米松治療組腹膜內(nèi)注射0.5 mg/(kg·d)地塞米松進(jìn)行治療。鹽水對(duì)照組每天腹膜內(nèi)給予鹽水進(jìn)行處理。未處理組同其他對(duì)照。

1.4 血清CA特異性抗體的測(cè)定 各實(shí)驗(yàn)組小鼠APTI測(cè)定結(jié)束后立即取血清并保存于-80℃。CA特異性IgE的測(cè)定用ELISA 方法[13]。

為了測(cè)定CA特異性IgG2a和IgG1，用CA包被酶標(biāo)板后進(jìn)行封閉和洗滌。樣品1∶50稀釋后加入酶標(biāo)板中4℃孵浴過(guò)夜。洗板后加入生物素化的大鼠抗小鼠IgG2a和IgG1的單抗，室溫孵浴45 min。加入親和素過(guò)氧化物酶(Sigma，1∶1000 稀釋)，室溫置 15 min。洗板后，加入 2，2＇-azine-bis，室溫置30 min，酶標(biāo)儀405nm處讀數(shù)。

由于沒(méi)有商業(yè)化小鼠抗CA抗體，小鼠CA抗原特異性IgE、IgG2a、IgG1的濃度計(jì)算參照測(cè)定小鼠抗 DNPIgE、IgG2a、IgG1時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡(jiǎn)單的講，DNP-清蛋白和CA以相同的濃度包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜、洗板并封閉。小鼠抗DNP IgE、IgG2a、IgG1抗體依次1∶2稀釋10次，分別加入10個(gè)孔中。，起始濃度為1000ng/ml。其他步驟同上。所有實(shí)驗(yàn)均采用雙孔，變異率＞10%則重復(fù)實(shí)驗(yàn)以保證實(shí)驗(yàn)的精確性。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞因子定量 每組實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞并懸于完全培養(yǎng)液中(RPMI1640中含10%的FBS，1%的青霉素和鏈霉素及1%的谷氨酰胺)。細(xì)胞在24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，每孔4×106/ml個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)液中含50 μg/ml的CA。細(xì)胞培養(yǎng)液中加入ConA(2 μg/ml)作為陽(yáng)性對(duì)照并設(shè)陰性對(duì)照。培養(yǎng)72 h后收集上清。脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-4IL-5IL-13和IFN-γ水平的測(cè)定用ELISA方法，操作參照說(shuō)明書(shū)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SigmaStat 2.03統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。各治療組之間的差異由ANOVA決定。

2 結(jié)果

2.1 中藥有效成分Vam3對(duì)抗原特異性抗體應(yīng)答的影響為了確定中藥有效成分Vam3治療對(duì)體液免疫應(yīng)答的影響，我們測(cè)定了血清CA特異性IgE和IgG2a的水平。如圖2所示，中藥有效成分Vam3治療組的IgE水平的顯著降低(P＜0.01)。與鹽水處理組相比，IgG2a的水平略有升高，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。地塞米松治療組的IgE水平顯著降低(與鹽水處理組相比，P＜0.01)，但本組IgG2a的水平也顯著降低(與鹽水對(duì)照組相比，P ＜0.05)。

2.2 Vam3對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子應(yīng)答的影響 為了確定中藥有效成分Vam3對(duì)于T細(xì)胞應(yīng)答類型的影響，我們通過(guò)脾細(xì)胞培養(yǎng)方法來(lái)評(píng)價(jià)Vam3和地塞米松對(duì)T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。如圖3所示，抗原致敏、發(fā)敏的鹽水處理組比空白對(duì)照組的IL-4、IL-5、IL-13水平顯著顯著升高，而IFN-γ水平顯著降低，表明應(yīng)答為T(mén)H2占優(yōu)勢(shì)的應(yīng)答。然而與鹽水處理組相比，中藥有效成分Vam3組的IL-4分泌被完全阻斷，而IL-5和IL-13的水平下降近40%。有趣的是，中藥有效成分Vam3治療組CA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌量比鹽水處理組升高約27%，且ConA誘導(dǎo)的IFN-γ水平與空白對(duì)照組相同。地塞米松治療組則不同，無(wú)IL-4分泌，且IL-5和IL-13水平顯著降低，但CA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌被阻斷，且ConA誘導(dǎo)的IFN-γ分泌比空白對(duì)照組顯著降低。

圖2 血清CA特異性抗體。(鹽水組，n=16;Vam3組，n=11，地塞米松組，n=12;空白對(duì)照組，n=14)進(jìn)行血清特異性抗體測(cè)定，用ELISA方法進(jìn)行。A:IgE水平B:IgG2a水平。數(shù)據(jù)均數(shù)±SEM由每組4-6只小鼠數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。

圖3 小鼠脾臟細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的產(chǎn)生。細(xì)胞分離后分別用含有CA(50 μg/ml)、ConA(2 μg/ml)和不含其他成分的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)72 h后收集上清。通過(guò)ELISA方法測(cè)定上清液中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。結(jié)果為重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。

3 討論

患有變應(yīng)性疾病的人或動(dòng)物模型，當(dāng)再次接觸過(guò)敏原后，IgE可以通過(guò)使肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞脫顆粒來(lái)介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)[14～17]。相反 IgG2a的產(chǎn)生則被認(rèn)為對(duì)機(jī)體有利[18]。以前的研究表明，一些抗炎的傳統(tǒng)中草藥方劑，如小青龍湯，可以抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的非特異性炎癥，表明可能對(duì)該類疾病具有治療作用[19]。Vam3 是從山葡萄根(Vitis Amurensis Rupr.)提取的二苯乙烯低聚體類化合物。研究表明，中藥有效成分Vam3治療后來(lái)可以顯著減少抗原特異性血清IgE的產(chǎn)生，IgG2a水平略有升高而IgG1水平下降。表明Vam3這種成分具有免疫調(diào)節(jié)作用，因而可能適于治療COPD、哮喘等呼吸道非特異炎癥性疾病。

正如Romagnani的綜述中所講[20]，TH2型細(xì)胞因子在哮喘的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。IL-4/IL-13促進(jìn)B細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生IgE和粘液分泌增多，而IL-5對(duì)于嗜酸性粒細(xì)胞的富集、活化和生存起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與鹽水處理組相比，Vam3下調(diào)了IL-4、IL-5和IL-13的水平。這些結(jié)果表明，中藥有效成分Vam3抑制非特異性氣道炎癥與其下調(diào)TH2應(yīng)答有關(guān)。中藥有效成分Vam3可以抑制3種主要的TH2型細(xì)胞因子，因而可以提供比單用抗IL-4、IL-5和IL-13更全面的的治療方法。

在這個(gè)模型中，地塞米松也可以抑制氣道炎癥。然而與中藥有效成分Vam3不同的是，地塞米松雙向抑制了TH1(IFN-γ/IgG2a)和 TH2(IL-4、IL-5、IL-13 和 IgE)應(yīng)答。與鹽水處理組比較，中藥有效成分Vam3治療組的IFN-γ水平較高，但并不高于空白對(duì)照組。這種免疫調(diào)節(jié)劑可能比用TH1型細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-12)和TH1型佐劑更加具有優(yōu)越性。因?yàn)樗粫?huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生比正常水平更高的TH1型細(xì)胞因子從而引起不必要的炎癥[21-23]。這些發(fā)現(xiàn)表明，中藥有效成分Vam3可能為臨床提供優(yōu)于糖皮質(zhì)激素的治療方法。

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