高宇,程俊文,賀亮,吳學(xué)謙﹡ ,李玉,付立忠,胡傳久

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食藥用菌教育部工程研究中心,長(zhǎng)春 130118;2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院,浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,杭州 310023)

蛹蟲草[Cordyceps militaris(L.erFr.)Link]又名北冬蟲夏草,北蟲草,屬子囊菌亞門蟲草屬。是蛹蟲草真菌寄生在鱗翅目夜蛾科昆蟲蛹體上形成的子座與僵死蛹體的結(jié)合體。近年研究發(fā)現(xiàn)其藥用價(jià)值和保健價(jià)值和冬蟲夏草相近[1]。蛹蟲草多糖粗提物是蛹蟲草重要生物活性物質(zhì),具有抗腫瘤、降血糖、抗肝纖維化作用[2]。

大豆含有大量的抗酸性物質(zhì),大豆低聚糖、大豆磷脂、大豆多肽、大豆異黃酮等多種功

能性成分。近年來(lái)科學(xué)研究表明,大豆所含有的功能因子具有較強(qiáng)的抗氧化作用,它可降低血糖和血壓,軟化血管,增強(qiáng)肌體免疫力,有抗癌、抗衰老的功效[3]。

20世紀(jì)90年代至今,液體發(fā)酵工程已得到廣泛的應(yīng)用,人們利用液體發(fā)酵,除獲得菌絲體外,還以獲取具有活性的次生代謝產(chǎn)物為目的[4]。但液體發(fā)酵由于培養(yǎng)基質(zhì)富含營(yíng)養(yǎng)較少,工藝相對(duì)簡(jiǎn)單,導(dǎo)致菌絲體內(nèi)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物較少,且液體發(fā)酵由于含水量大易污染造成巨大損失。固體發(fā)酵由于含水量少具有不易污染,基質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分豐富,節(jié)約能源等特點(diǎn),近些年逐漸得到人們的重視。因此大力發(fā)展固體發(fā)酵新思維成為眼下的耽誤之及。

本實(shí)驗(yàn)試將蛹蟲草與經(jīng)過(guò)處理的大豆采用固體發(fā)酵方法結(jié)合,借鑒莊毅固體雙向發(fā)酵的思路使兩種物質(zhì)產(chǎn)生雙向作用從而促進(jìn)有效活性物質(zhì)更好的產(chǎn)生[5-6]。本論文主要從多糖方面著手,利用正交試驗(yàn)篩選出此種菌質(zhì)中多糖提取最佳工藝,檢測(cè)菌質(zhì)多糖的抗氧化性,進(jìn)而分離多糖組分,為后續(xù)研究找尋新組分和活性成分提供基礎(chǔ)性指導(dǎo)。[7]。

1 材料與方法

1.1 菌質(zhì)制備

1.1.1 材料

1.1.1.1 菌種。由浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所提供的蛹蟲草菌株CM01。

1.1.1.2 培養(yǎng)基。籽粒飽滿的發(fā)芽大豆。

1.1.2 方法

1.1.2.1 培養(yǎng)基制備。將液體蛹蟲草搖瓶種子液接種在發(fā)芽2天經(jīng)高溫高壓滅菌后的大豆培養(yǎng)基上10mL,避光恒溫培養(yǎng)30天或至菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基,培養(yǎng)溫度為25℃。

1.1.2.2 菌質(zhì)處理。培養(yǎng)好的菌質(zhì)真空冷凍干燥后,研磨過(guò)40目篩,4℃冰箱保存待用。

1.2 菌質(zhì)粗多糖的提取

1.2.1 菌質(zhì)多糖的提取

1.2.1.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。多糖具有很好的水溶性,且超聲提取易破壞多糖結(jié)構(gòu),故采用回流提取法,用蒸餾水來(lái)提取,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了影響多糖得率的四個(gè)因素:提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、料水比(C)、提取次數(shù)(D);然后通過(guò)四因素三水平L9(34)正交實(shí)驗(yàn)篩選出一個(gè)最佳提取組合,因素水平安排見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素、水平安排表

1.2.1.2 苯酚-硫酸法測(cè)定蟲草多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密稱取0.1g經(jīng)過(guò)105℃干燥至恒重的分析純葡萄糖(AR),加水稀釋至100mL,搖勻后從中吸取10mL,用蒸餾水定容至250mL,即得濃度為40μ g/mL的葡萄糖母液。從母液中精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,分別用蒸餾水補(bǔ)至 2mL 置于10mL具塞刻度試管中,用旋渦混勻器振勻。分別依次加入6%苯酚溶液1 mL,濃硫酸 5 mL,搖勻放置10min,沸水浴加熱15min,冷卻至室溫,在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[8-9],得出線性方程;同時(shí)還對(duì)該方法的回收率、穩(wěn)定性、重復(fù)性和換算因子F值進(jìn)行了考察。

1.2.1.3 供試品溶液的制備。首先將待測(cè)菌質(zhì)烘干,精密稱取菌質(zhì)粉末,每份約0.5g,進(jìn)行3次重復(fù)分別按正交表的要求操作;提取后離心,合并上清液,55℃減壓濃縮至10mL,95%的乙醇醇沉,樣品和乙醇體積比為1︰5,得到的多糖,定容至50mL容量瓶中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.4 顯色反應(yīng)。精密量取上述供試溶液2mL置于10mL具塞刻度試管中,依次加入6%苯酚溶液lmL,濃硫酸 5 mL,搖勻放置 10min,沸水浴加熱15min,冷卻至室溫,在 490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,代入線性方程計(jì)算百分含量。

1.3 提取粗多糖的抗氧化性測(cè)定(DPPH法)

1.3.1 溶液配制

稱取3mgDPPH溶于100mL乙醇溶液中,即制成濃度為75μ m/L的DPPH溶液。分別稱取粗多糖樣品0.0005、0.002、0.004、0.006、0.008g 分別溶于 10mL超純水中 ,即配制成濃度為 50、200、400 、600、800μ g/mL的待測(cè)溶液。

1.3.2 測(cè)定方法

移取不同濃度的樣品0.3mL置10mL具塞試管中,分別加入0.2mL的乙醇溶液,2.5mL的DPPH溶液混合均勻,放入暗處30min后,在 517nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)下列公式計(jì)算各樣品溶液對(duì)DPPH自由基的清除率:?DPPH清除率=A0-(A-AB)/A0×100%。A為加樣品溶液與DPPH溶液的吸光度;A0為不加樣品溶液的DPPH溶液的吸光度;AB為不加DPPH溶液的樣品溶液。

1.4 粗多糖的分離

1.4.1 樣品制備

精密稱取粗多糖0.01g置于10mL容量瓶中,蒸餾水定容,所得濃度為10mg/mL的多糖溶液。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為:陰離子交換柱 DEAE-Sepharose Fast Flow。洗脫條件為:濃度為0.05mol/L,

pH7.8的Tris-Hcl緩沖液,洗脫條件梯度:0、0.15 、0.25 、0.35 、0.5 、0.75 、1mL 。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光值為橫坐標(biāo)(x),以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL)為縱坐標(biāo)(y)得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明葡萄糖在0.016～0.072mg/mL呈良好的線形關(guān)系,回歸方程為:y=2.9981x-0.0243,(R2=0.9947)(如圖1)。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量的條件經(jīng)單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)而得,經(jīng)方法學(xué)考察此方法操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性生好,精密度高。

2.2 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)影響多糖提取效果的4個(gè)主要因素進(jìn)行研究,按表1所示的因素水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),分析結(jié)果如表2與表3所示。經(jīng)方差分析得出A因素對(duì)多糖的提取影響顯著,因素B、C和D則影響不顯著,極差分析表明四個(gè)因素對(duì)多糖影響效果由大到小順序?yàn)?A＞D＞C＞B,由直觀分析得出多糖的最佳提取條件為A3B2C2D3,即80℃下,料液比為1︰30,回流提取 2h,提取次數(shù)3次。由于提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖提取影響較小,因此為簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)提取條件定為80℃下,料液比1︰20回流提取1h,提取次數(shù)3次。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),得多糖含量為6.93%。

表2 多糖提取正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.3 清除DPPH自由基的能力

2.3.1 不同濃度下樣品吸光度及DPPH的清除率

不同濃度下的多糖溶液的抗氧化性如表4所示,隨著樣品溶液濃度的增大,其DPPH的清除率越大,且清除率均在50%以上,比此前報(bào)道的有很大程度的提高[10],說(shuō)明此種發(fā)酵菌質(zhì)粗多糖在抗氧化性上有較明顯的作用。

表4 DPPH清除率

2.4 粗多糖的分離結(jié)果

收集出峰處溶液,過(guò)膜后冷凍干燥得3個(gè)多糖蛋白,洗脫結(jié)果見圖 1。如圖所示,59min、85min、218min時(shí)各有一個(gè)蛋白峰,其中以85min時(shí)的峰值最高(圖2)。與之相應(yīng)的3個(gè)多糖峰通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)得?？梢姶硕嗵怯?種不同結(jié)構(gòu)的單糖組成。單糖結(jié)構(gòu)還有待于我們下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

圖2 多糖洗脫圖

3 討論

在多糖提取方法的選擇中,超聲方法雖然簡(jiǎn)便但因?yàn)槌晻r(shí)間若掌握不好會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)有影響,為保證后續(xù)多糖分析實(shí)驗(yàn)的精準(zhǔn),本實(shí)驗(yàn)選擇了回流提取法,回流提取方法雖耗時(shí)較長(zhǎng)但是操作簡(jiǎn)便、條件易于控制;而正交實(shí)驗(yàn)既包含了單個(gè)因素對(duì)多糖提取條件的影響,又包含了多個(gè)因素間的協(xié)同作用,大大減少了實(shí)驗(yàn)中的設(shè)計(jì)組合,因此可以得出,采用回流提取正交實(shí)驗(yàn)的方法在多糖提取中既簡(jiǎn)單又精準(zhǔn)。對(duì)于提取得到的粗多糖我們進(jìn)行了抗氧化性的測(cè)試,結(jié)果比以往的文獻(xiàn)報(bào)道效果要好的多,說(shuō)明此種培養(yǎng)基發(fā)酵的菌質(zhì)多糖比液體發(fā)酵的菌絲體提出的多糖對(duì)DPPH的清除率要高,至于提取出的粗多糖是由幾種組分構(gòu)成的,我們又將提取得到的多糖過(guò)陰離子柱后,得到3種不同相對(duì)分子質(zhì)量的多糖蛋白,它們的含量不同,且純度還需要經(jīng)電泳、高效液相色譜等方法來(lái)鑒定。對(duì)于是哪種組分對(duì)DPPH的清除起作用這個(gè)還未探明。多糖活性與結(jié)構(gòu)之間存在很大的關(guān)系,因此今后的實(shí)驗(yàn)將主要圍繞分析多糖的活性和探明結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)聯(lián)來(lái)開展。

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