韋朝陽，徐財(cái)泉，茆廣華，葉長文，吳應(yīng)淼，李衛(wèi)旗＊

（1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2.浙江方格藥業(yè)有限公司；3.浙江慶元縣食用菌科學(xué)技術(shù)研究中心）

灰樹花（Grifolafrondosa）屬擔(dān)子菌亞門、多孔菌科、樹花屬。又名、栗子蘑、蓮花菌、千佛菌、云蕈。日本稱舞茸、葉狀奇果菌。是食、藥用菌。灰樹花子實(shí)體具有獨(dú)特的芳香味，口味鮮美，富含多種維生素、礦物質(zhì)與生物活性物質(zhì)，是近年來我國和日本正在推廣的一種珍貴食、藥兼用真菌[1]。自1984年 Ohno等[2]報(bào)道了灰樹花多糖具有抗腫瘤活性以來，對灰樹花多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及保健功能的研究已逐步展開，其對人體良好的生理功能調(diào)節(jié)作用也逐漸被人們認(rèn)識(shí)。大量的藥理分析與臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)，灰樹花多糖具有明顯的抗腫瘤、改善免疫系統(tǒng)功能、抗HIV病毒、調(diào)節(jié)血糖、血脂及膽固醇水平，對防止癌細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)移、高血壓、肥胖癥、糖尿病、艾滋病及免疫系統(tǒng)功能的紊亂都有一定的療效。特別是其抗腫瘤活性，日本醫(yī)學(xué)專家用灰樹花多糖進(jìn)行抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，灰樹花多糖的抑瘤率可達(dá)86.2%，比國際公認(rèn)的抗癌新藥香菇多糖抑制率高32%[3]。對灰樹花多糖的分離提取，傳統(tǒng)的方法是對子實(shí)體熱水浸提后再用乙醇沉淀。

由于灰樹花中含有大量的纖維素﹑果膠﹑蛋白質(zhì)等非多糖類大分子物質(zhì)，形成了較為致密的子實(shí)體結(jié)構(gòu)，大大阻礙了多糖在浸提過程中的釋放。進(jìn)而人們使用含纖維素酶﹑果膠酶﹑蛋白酶等生物酶類組合的復(fù)合酶制劑對灰樹花子實(shí)體進(jìn)行處理，以降解非多糖類物質(zhì)，使細(xì)胞內(nèi)外的多糖更有效地被提取出來[4]。由于不同的酶類達(dá)到最高酶活力所需的酶解溫度和酶解時(shí)間等條件各不相同，一次性地使用復(fù)合酶制劑對多糖提取效果的改善仍不理想。因此，本文在優(yōu)化各單一酶的作用條件下，將灰樹花子實(shí)體干粉依次采用纖維素酶﹑果膠酶﹑蛋白酶分步處理，使每種酶的活力得到充分發(fā)揮，從而最大程度地提高灰樹花多糖提取率和純度。

1 材料與方法

1.1 材料

灰樹花子實(shí)體（去柄），由浙江方格藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試劑

纖維素酶，上海伯奧生物試劑廠；木瓜蛋白酶，四川攀枝花市酶制劑廠；果膠酶，F(xiàn)luka公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 灰樹花多糖的熱水浸提

取100g灰樹花子實(shí)體干燥粉碎后，加入2000mL蒸餾水90℃下浸提4h，真空抽濾后濾液濃縮至原體積的1／10，向濃縮液中加入其4倍體積的95%乙醇，攪拌后靜止12h，3000rpm離心10min，去除上清液，沉淀用無水乙醇和丙酮交替潤洗兩次60℃烘干后得灰樹花粗多糖，稱重。

1.4 灰樹花多糖的酶法提取

取100g灰樹花子實(shí)體干燥粉碎后，加入2000mL蒸餾水，常溫浸泡2h，調(diào)整pH值和溫度至設(shè)定值，加入設(shè)定量的酶制劑，按設(shè)定時(shí)間進(jìn)行酶解，真空抽濾后濾液濃縮至原體積的1／10，向濃縮液中加入4倍體積95%乙醇，攪拌后靜止12h，3000rpm離心10min，去除上清液，沉淀用無水乙醇和丙酮交替潤洗兩次，60℃烘干后得灰樹花粗多糖，稱重。

1.5 灰樹花多糖的分步酶解法提取

首先采用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶分別單獨(dú)對灰樹花子實(shí)體樣本進(jìn)行酶解提取多糖，計(jì)算各自的多糖提取率，獲得各種酶的最佳工藝參數(shù)。然后在各種酶的最佳工藝條件下，依次采用三種酶對同一灰樹花子實(shí)體樣本進(jìn)行分步處理，最終計(jì)算多糖的提取率，并與熱水浸提法及單一酶法提取灰樹花粗多糖提取率的結(jié)果進(jìn)行對照。本實(shí)驗(yàn)對三種酶的四個(gè)工藝條件因素設(shè)定如下：因素A（相對灰樹花原料的加酶量，%），因素B（酶解溫度，℃），因素 C（酶解pH值），因素D（酶解時(shí)間，h）。參照各種酶產(chǎn)品說明書提供的酶活條件范圍，各因素設(shè)置三個(gè)水平，采用四因素三水平的L9（34）正交表設(shè)計(jì)因素水平表，以多糖的提取率為指標(biāo)，通過極差分析，確定各種酶的最佳工藝組合。

1.6 多糖提取率公式

多糖提取率＝（粗多糖質(zhì)量／灰樹花粗粉質(zhì)量）×100%

1.7 多糖的純化與光譜分析

灰樹花多糖的純化采用Sevag法[5－6]；樣品水溶液在200～400nm區(qū)間722型光柵分光光度計(jì)掃描進(jìn)行紫外光譜分析；紅外光譜分析采用Specerd IP紅外光譜儀，KBr壓片。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶提取灰樹花多糖的工藝條件優(yōu)化

表1 纖維素酶正交試驗(yàn)因素水平表

表2 纖維素酶提取灰樹花多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果

對纖維素酶設(shè)定的工藝因素水平見表1。以多糖提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。由正交試驗(yàn)表的極差分析看出，其中各因素對提取率的影響順序依次為：d加酶量＞b初始pH值＞c加熱溫度＞a加熱時(shí)間。由直觀分析得到最佳纖維素酶提取工藝組合為Ea1b3c1d3，即當(dāng)加熱時(shí)間為60min，初始pH值調(diào)至4.5，加熱溫度40℃，加酶量為1.5%。實(shí)驗(yàn)證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達(dá)23.41%。

2.2 果膠酶提取灰樹花多糖的工藝條件優(yōu)化

表3 果膠酶正交試驗(yàn)因素水平表

表4 果膠酶提取灰樹花多糖的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由正交試驗(yàn)表的極差分析看出，其中各因素對提取率的影響順序依次為：c加熱溫度＞d加酶量＞b初始pH值＞a加熱時(shí)間。由直觀分析得到最佳果膠酶提取工藝組合為Ea3b2c2d3，即當(dāng)加熱時(shí)間為180min，初始pH值調(diào)至4，加熱溫度60℃，加酶量為1.5%。實(shí)驗(yàn)證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達(dá)24.53%。

2.3 木瓜蛋白酶提取灰樹花多糖的工藝條件優(yōu)化

對木瓜蛋白酶設(shè)定的工藝因素水平見表5，以多糖提取率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表6。

表5 木瓜蛋白酶正交試驗(yàn)因素水平表

表6 木瓜蛋白酶法提取多糖的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6結(jié)果表明，對木瓜蛋白酶而言，因素A（加熱時(shí)間）的極差值最大，對多糖的提取率影響最大，因素D（加酶量）影響最小。由直觀分析得到最佳果膠酶提取工藝組合為Ea3b1c2d2，即當(dāng)加熱時(shí)間為180min，初始pH值調(diào)至5，加熱溫度60℃，加酶量為1.0%。實(shí)驗(yàn)證明，在此條件下，灰樹花多糖提取率可達(dá)25.78%。

2.4 分步酶解法提取的粗多糖提取率對比試驗(yàn)

圖1 多種提取方法的多糖提取率比較

采用以上3種酶的最佳工藝條件依次對同一批灰樹花子實(shí)體樣品進(jìn)行處理后，并與熱水浸提法及單一酶法提取灰樹花粗多糖提取率的結(jié)果進(jìn)行對照，結(jié)果如圖1。由圖1可知，相對熱水浸提法，3種單一酶提取灰樹花子實(shí)體多糖都不同程度地提高了多糖的提取率。采用3種酶依次對同一批灰樹花子實(shí)體樣本進(jìn)行分步處理后（即分步酶解法提取多糖），粗多糖提取率有了顯著提高。對照熱水浸提法的多糖提取率為20.38%，依次采用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶分步酶解法提取灰樹花多糖的提取率達(dá)28.62%，提高了40.4%。由此可見在對灰樹花子實(shí)體中的纖維素、果膠及游離蛋白等非多糖類大分子進(jìn)行充分酶解后，細(xì)胞內(nèi)外的多糖成分獲得了有效的釋放。

2.5 灰樹花多糖的紫外光譜分析

將熱水浸提的粗多糖和分步酶法提取獲得的粗多糖各進(jìn)行5次Sevag法去蛋白萃取處理后，獲得提純后的灰樹花多糖樣品1和樣品2，作紫外光譜分析，結(jié)果如圖2、圖3。由圖2、圖3可見，樣品1在280nm波長處仍有明顯吸收峰，說明由熱水浸提法提取的粗多糖中由于結(jié)合蛋白較為牢固，經(jīng)Sevag法去蛋白處理后仍不能完全去除。而樣品2在280nm波長處已沒有吸收峰，說明由分步酶解提取法提取的粗多糖中的結(jié)合蛋白在經(jīng)Sevag法去蛋白處理后即能較完全地去除，多糖純度得以提高[7]。

圖2 樣品1的紫外光譜

圖3 樣品2的紫外光譜

2.6 灰樹花多糖的紅外光譜分析

將提純后的灰樹花多糖樣品2再進(jìn)行紅外光譜測試，圖4為其紅外圖譜。圖4中的峰很好地反映了灰樹花多糖的β－葡聚糖的特性。3422cm－1出現(xiàn)一寬峰表示有O-H的伸縮振動(dòng)，2927cm－1的弱吸收是C-H的特征峰，1634cm－1是C＝O的伸縮振動(dòng)造成的1389cm－1的峰是 C-H 的變角振動(dòng)，1250cm－1～950 cm－1的這組強(qiáng)吸收峰是吡喃糖環(huán)的醚鍵（C-O-C）和羥基的吸收峰。化合物分子在紅外光譜圖譜上的每一個(gè)吸收峰，都對應(yīng)于分子中原子或官能團(tuán)的振動(dòng)情況。不同的分子具有一系列不同的吸收峰。多糖化合物在紅外光譜圖中具有一些特征峰，利用這些特征峰就能夠確定多糖的一些基本結(jié)構(gòu)。以上紅外光譜的基本信息與作為吡喃型β－葡聚糖的灰樹花多糖的一些基本結(jié)構(gòu)的信息是完全符合的。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用纖維素酶﹑果膠酶﹑木瓜蛋白酶在各自的最佳酶解條件下分步處理灰樹花子實(shí)體后，多糖能有效地得到釋放，灰樹花粗多糖的提取率可達(dá)28.62%，比傳統(tǒng)的熱水浸提法要提高40.4%，灰樹花多糖提取率得到大幅提高，從而為灰樹花多糖的高效提取提供了一種新的工藝。通過紫外光譜掃描分析表明，經(jīng)分步酶解法提取灰樹花多糖中的蛋白含量遠(yuǎn)低于熱水浸提法提取的灰樹花多糖，多糖純度明顯提高。通過紅外光譜檢測結(jié)果顯示，經(jīng)分步酶解法提取的灰樹花多糖含有吡喃型β－葡聚糖的結(jié)構(gòu)，與常規(guī)提取方法所得的灰樹花多糖具有一致的結(jié)構(gòu)特征。

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