劉淑君，楊悅儉，葉青靜，王榮青

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華 321004;2.浙江省農(nóng)業(yè)科學研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

傳統(tǒng)的番茄品種鑒定有形態(tài)學［1］、細胞學［2］及同工酶法［3］等，但其結(jié)果易受環(huán)境條件影響，或因多態(tài)性低，使應用范圍受到限制，對于基因型的準確鑒定更為困難。DNA分子標記為蔬菜品種鑒定開辟了嶄新的研究和應用領域，它有助于直接從分子水平上了解蔬菜品種間的差異，使育種過程更直觀，目的性更強，對于選擇合適的雜交組合以保持或獲得更好的重組優(yōu)良品種顯得極為有效與準確。其中，AFLP (amplified fragment length polymor-phism)是在RAPD和RFLP標記系統(tǒng)基礎上發(fā)展而來的一種分子標記技術［4］，具有可同時對多位點進行檢測、重復性好、信息量大、符合孟德爾遺傳的特點，非常適合品種多樣性檢測和品種鑒定。本研究利用 AFLP技術對12個番茄品種材料進行DNA多態(tài)性分析，并以篩選的6對引物的擴增結(jié)果為依據(jù)，建立番茄品種鑒定方法，以期為生產(chǎn)上番茄品種的判斷提供新的科學方法?，F(xiàn)將有關結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的番茄品種 (育種材料)共 20個:9179、198、07-020、07-021、07-025、07-026、07-027、07-029、9818、浙粉 208、浙粉 202、浙雜203、浙雜 210、浙雜 2218、浙雜 2102、浙雜6299、浙雜 2346、浙雜 1802、浙雜 205、以色列189(表 1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

所有番茄材料播于15孔的育苗穴盤中，育苗基質(zhì)采用草炭、蛭石體積比2∶1，待番茄幼苗長出2片子葉時，提取子葉DNA進行分析。

DNA提取參照姚金曉等［5］的CTAB小量提取方法，并進行改良。1.5 mL離心管加入新鮮葉片0.01 g;加入250 μL CTAB緩沖液 (100 mL 1 mol·L-1TRIS pH 7.5，140 mL 5 mol·L-1NaCl，20 mL 0.5 mol·L-1EDTA pH 8.0，740 mL MiliQ H2O，20 g CTAB)，用尖頭玻棒輕輕研磨，然后再加入250 μL CTAB混勻;65℃水浴1 h;置于4℃冰箱或室溫冷卻至15℃以下;加入250 μL 24∶1氯仿/異戊醇，上下混勻5 min，保證樣品與氯仿充分混和;12 000 r·min-1離心10 min;取上清液 200 μL，加入預先加好200 μL異丙醇的1.5 mL離心管中，輕輕上下顛倒混勻;4℃冰箱靜置30 min以上;10 000～12 000 r·min-1離心10 min，棄上清液;吹干DNA，讓異丙醇揮發(fā)干凈;加入 100 μL ddH2O(含1 μL 10 mg·mL-1的RNase)溶解DNA;37℃水浴或室溫1 h去除RNA;然后用1%的瓊脂糖電泳檢測。提取的DNA貯備在-20℃的冰箱中備用。

1.2.2 AFLP分析

參照Vos等［6-7］方法，并進行了改良。

1.2.3 模板DNA酶切及連接

表1 供試20份番茄育種材料 (或品種)的名稱、來源及主要特性

每個反應總體積為 25 μL，其中包括:DNA 250 ng，Eco R I 1.25 U(10 U·μL-1)和Mse I 2.5 U(10 U·μL-1)，Eco R I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，Mse I adaptor 0.5 μL(5 pmol·μL-1)，ATP 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×buffer(with BSA)5 μL，T4 DNA Ligase 1 U(5 U·μL-1)，ddH2O 15.425 μL，混勻后37℃水浴3 h以上。

1.2.4 DNA片段預擴增

取2.5 μL連接酶切后 DNA模板，加入22.5 μL的預擴增混合液:Eco R I引物0.7 μL(50 ng·μL-1)和 Mse I引物0.7 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.5 μL(10 mmol·L-1)，10 ×反 應 緩 沖 液 2.5 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol· L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，無菌純水15.9 μL?；靹蚝?，按如下PCR程序擴增:94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸1 min，共21個循環(huán)。取5 μL預擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖上電泳，用EB染色，Bio-RAD凝膠成像系統(tǒng)顯示。預擴增產(chǎn)物稀釋20～50倍，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 選擇性AFLP擴增

取2.5 μL稀釋后的預擴增混合液，加入17.5 μL選擇性擴增混合液:Eco R I選擇性擴增引物0.1 μL(50 ng·μL-1)和Mse I選擇性擴增引物0.6 μL(50 ng ·μL-1)，dNTPs 0.4 μL(10 mmol·L-1)，10 × 反應緩沖液2 μL(100 mmol·L-1Tris-HCl［pH 9.0］，80 mmol·L-1(NH4)2SO4，100 mmol·L-1KCl，NP-40)，Mg2+1.6 μL(25 mmol·L-1)，Taq 酶0.2 μL(5 U·μL-1)，無菌純水12.6 μL?；靹蚝螅慈缦翽CR程序擴增:94℃預變性2 min后;94℃變性30 s，64℃復性 (每循環(huán)降低0.7℃)30 s，72℃延伸1 min，12個循環(huán)后;94℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸1 min，28個循環(huán);最后72℃延伸7 min。反應結(jié)束后向選擇性擴增產(chǎn)物中加入等體積的上樣緩沖液(98%甲酰胺，10 mmol·L-1EDTA［pH 8.0］，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯腈)，98℃變性6 min，立即置于冰上冷卻，待用。

1.2.6 擴增產(chǎn)物聚丙烯酰胺電泳分析

經(jīng)預電泳 (40 W恒功率)30 min后，取5 μL上樣混合物于6%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分析 (40 W恒功率)，電泳至二甲苯腈指示帶位于同一預定位置時終止。

1.2.7 銀染成像

按照 Ceatano-Anolles等［8］的方法染色。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)各番茄品種基因組DNA的AFLP標記檢測結(jié)果，選取清晰可辨的擴增條帶用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。分別以1和0代表在某一遷移率處有或無擴增片斷 (譜帶)出現(xiàn)，將獲得的AFLP指紋圖譜轉(zhuǎn)換為1和0構(gòu)成的數(shù)字矩陣，計算各品種中出現(xiàn)的所有遷移率不同的擴增譜帶數(shù)目、多態(tài)性譜帶數(shù)目及其比例、品種間的共有譜帶率等的各項參數(shù)。其中共有譜帶率 (BS-Band Sharing)的計算公式［9］為:BS=2 Nab/(Na+Nb)，公式中Nab表示A與 B 2個品種的共同譜帶數(shù)，Na、Nb則分別表示 A與 B 2個品種各自的總譜帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFLP技術效果

實驗通過對引物的篩選，初步篩選出6對AFLP選擇性引物，并對8個番茄材料及4個番茄品種進行AFLP分析，都得到了清晰的指紋，并且所有的材料均表現(xiàn)出多態(tài)性，這可從引物組合EACA/M-CTA的指紋 (圖1)情況看出。

圖1 12個番茄材料的AFLP指紋圖譜

6對引物的擴增結(jié)果 (表2)顯示:共擴增了130條帶，平均每對引物擴增21.2條帶，其中有多態(tài)性條帶80條，平均每對引物擴增多態(tài)性帶13.3條，多態(tài)性比例62%。不同引物組合揭示多態(tài)性的能力有差別。引物E-ACC/M-CTG擴增的多態(tài)性條帶最少，為8條，對供試番茄材料的區(qū)分率為50%;而E-ACA/M-CTA擴增的多態(tài)性條帶最多，為24條，多態(tài)性比例高達75%，對供試番茄材料的區(qū)分率為100%。

2.2 AFLP指紋分析

2.2.1 8個番茄材料的分析

表2 6對AFLP引物對12個番茄材料的擴增結(jié)果

根據(jù)6對引物的指紋情況，隨機選擇了8個番茄材料18對組合進行比較。18對番茄材料間的共有譜帶率 (BS)分析結(jié)果 (表3)表明，這些番茄材料間的BS大小的變化范圍為54%～93%，平均為82%。根據(jù)以往的報道，BS值越大則其遺傳關系越近，而BS值越小則遺傳關系越遠，進行遺傳改良的潛力越大，遺傳差異大的品種更適于作為育種親本材料。實驗結(jié)果證明了AFLP篩選番茄親本的有效性。

表3 8個番茄材料間的共有譜帶率

2.2.2 指紋圖譜構(gòu)建與品種鑒定

以應用 E-ACG/M-CTG、E-ACG/M-CAT和 EACA/M-CTA引物構(gòu)建的6個番茄品種的AFLP指紋圖譜 (圖2)為例，3對引物共擴增出45條帶，其中多態(tài)性帶18條，占40%，對6個番茄品種的區(qū)分率達100%，可成為AFLP技術鑒定這些番茄品種的依據(jù)。

圖2 6個番茄材料的AFLP指紋圖譜

研究還發(fā)現(xiàn)，一些擴增帶僅在部分番茄品種中出現(xiàn)，例如圖2條帶 b、c、d與 h只出現(xiàn)在9179中，一旦這些條帶被確認具有品種的特異性，即可通過特征指紋快速鑒別番茄品種，從而大大提高鑒定效率。

3 小結(jié)與討論

DNA分子標記是基因型在DNA水平上的表現(xiàn)形式，代表著品種間本質(zhì)的差異，是繼形態(tài)標記、生化標記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標記。為加快DNA分子標記技術在番茄育種實踐中的應用，提高育種水平，人們已成功地將RAPD［9-10］(隨機擴增多態(tài) DNA)、SSR(簡單序列重復)［11］及 AFLP技術應用于番茄的遺傳關系［12］、品種鑒定［13］等方面的研究。

利用分子標記可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關系，指導雜交育種親本選配［14］，減少雜交組合數(shù)［15］，有效劃分雜種優(yōu)勢群［16］，為提高育種效率提供有效手段。通過親緣關系分析，可以糾正形態(tài)分類中一些不恰當?shù)慕Y(jié)論以及目前育種工作中存在的一些問題。本研究的初步分析結(jié)果表明，不同番茄材料間AFLP指紋的BS值存在明顯的差異，因此可以利用DNA指紋計算個體或品種間的BS值，以此估計它們之間的遺傳距離，作為育種親本選擇的參考。

用AFLP方法得到的指紋圖譜具有穩(wěn)定可靠且多態(tài)性豐富的優(yōu)點，非常適合于品種鑒定等方面的應用。本研究采用6對引物對6個番茄品種進行的AFLP分析，能夠產(chǎn)生較為豐富的多態(tài)性以及穩(wěn)定的AFLP標記，可區(qū)分6個番茄品種，并可作為6個番茄品種鑒定的依據(jù)。本研究建立的是一個利用DNA指紋來進行番茄品種鑒定的模型，雖然僅研究了6個番茄品種，然而研究的品種數(shù)量是可以增加的，而且隨著品種和所用引物數(shù)量的增加，得到的結(jié)果會更準確。利用本研究建立的方法可以為保護番茄育種產(chǎn)權(quán)、登錄新品種、鑒定和檢測苗木真實性和純度等提供客觀、科學和準確的技術保障。

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