劉穎娜 李東至

(廣州醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州市婦女兒童醫(yī)療中心產(chǎn)前診斷中心,廣東廣州 510623)

致死性骨發(fā)育不良(Thanatophoric dysp lasia,TD)是常見(jiàn)的致死性骨骼發(fā)育不良疾病,屬常染色體顯性遺傳病,發(fā)生率約為活產(chǎn)的(0.21～0.30)/10 000[1]。主要表現(xiàn)為嚴(yán)重短肢、短指/趾、頭大、前額突出、鼻梁塌陷、胸廓狹窄、小肋、腹膨隆、扁平椎及軀干長(zhǎng)度正常等[2,3]。TD屬于致死性疾病,患者大多在圍產(chǎn)期死亡,存活者生存期很少超過(guò)6個(gè)月,死因多是由于胸腔狹窄導(dǎo)致的肺發(fā)育不全或枕骨大孔狹窄導(dǎo)致的中樞性呼吸抑制[4]。

TD患兒多在產(chǎn)前經(jīng)超聲檢查發(fā)現(xiàn)。TD可分為2型,I型(TD I)更常見(jiàn)。典型超聲特點(diǎn)為[2]:長(zhǎng)骨顯著縮短、股骨短小如“電話聽(tīng)筒”狀、胸腔狹窄、肋骨縮短等。但僅靠超聲檢查不易與其他骨發(fā)育異常疾病鑒別,分子診斷有助于確診。本文報(bào)告2例應(yīng)用高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting analysis,HRM)快速產(chǎn)前診斷TD I。

1 臨床病例報(bào)告

1.1 病例1 孕婦23歲,G1P0,妊娠20周超聲檢查發(fā)現(xiàn):雙頂徑 49.2 mm,胸圍113.6 mm,股骨長(zhǎng)15.9/13.1mm,形狀似“電話聽(tīng)筒”(圖 1A)。胎兒雙頂徑與孕周相符,胸廓狹小、股骨短而彎曲,考慮TDI,遺傳咨詢后孕婦決定行羊膜腔穿刺術(shù),抽取羊水行細(xì)胞遺傳學(xué)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)基因突變檢查。

1.2 病例2 孕婦30歲,G2P0,妊娠27周超聲檢查發(fā)現(xiàn):雙頂徑 68.4 mm,頭圍249.5 mm,胸圍141 mm,腹圍201.5 mm,股骨長(zhǎng) 16.1/14.2 mm,“電話聽(tīng)筒”特征不典型(圖1B)。胎兒雙頂徑、頭圍與孕周相符,胸廓狹小、股骨短而彎曲,首先考慮TD I。遺傳咨詢后孕婦接受臍帶血管穿刺術(shù),取胎血行細(xì)胞遺傳學(xué)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR3)基因突變檢查。

圖1 2例胎兒股骨的超聲圖像(A:病例1;B:病例2)

2 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

2.1 染色體核型分型 采用細(xì)胞遺傳室常規(guī)的羊水細(xì)胞和臍帶血淋巴細(xì)胞染色體制備技術(shù)。

2.2 HRM檢測(cè)

2.2.1 DNA提取 羊水和胎血標(biāo)本采用Qiagen DNA Mini kit(Qiagen,Germany)試劑盒提取DNA,按使用說(shuō)明操作。

2.2.2 PCR擴(kuò)增 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增FGFR3基因第7外顯子包含c.742位點(diǎn)的區(qū)域,引物序列分別為:正 向 5′-CCCTGAGCGTCATCTGCC-3′,反 向 5′-GCACCGCCGTCTGGTTG-3′(NCBI reference sequence NC_00000 4.10)。PCR反應(yīng)總體積為10μL,包括:dNTP各 200μM、正反向引物各1.6 pM 、0.5U Taq DNA 聚合酶(Promega)、5 μL 2×GC bufferⅠ(T akaRa)、20 ng基因組DNA 模板、1μL 10×LCG reen Plus。用 LightScanner(Idaho Technology)專用的 96孔板在熱循環(huán)儀(Tprofessional,biometra)上擴(kuò)增模板。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 3分鐘;隨后94℃變性 20 s,65℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40個(gè)循環(huán);最后94℃30 s,25℃30 s形成異源雙鏈。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為85 bp。

2.2.3 HRM分析 PCR擴(kuò)增完成后,將96孔板移至LightScanner(Idaho Technology)進(jìn)行熔解曲線分析。LightScanner溫度范圍設(shè)置為70～98℃,溫度變化速度0.1℃/s。持續(xù)監(jiān)測(cè)熒光變化,采集數(shù)據(jù),獲得熔解曲線,整個(gè)過(guò)程大概5分鐘。應(yīng)用LightScanner Softwarewith Call-IT 2.0軟件分析數(shù)據(jù)。整個(gè)PCR反應(yīng)和HRM分析過(guò)程不超過(guò)2個(gè)小時(shí)。

2.3 DNA序列測(cè)定 對(duì)H RM分析陽(yáng)性樣本進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序分析。

3 結(jié)果

3.1 病例1 羊水細(xì)胞核型分型結(jié)果正常(46,XX),H RM檢測(cè)FGFR3基因第7外顯子示為c.742C＞T(p.R248C)雜合突變,其HRM 熔解曲線與c.742C＞T雜合突變陽(yáng)性對(duì)照樣本的熔解曲線集成一簇,與野生型明顯區(qū)分開(圖2A)。結(jié)果被基因測(cè)序證實(shí)(圖3A)。

圖2 FGFR3基因第7外顯子的HRM Difference Curves分析結(jié)果,

3.2 病例 2 臍血細(xì)胞核型分型結(jié)果正常(46,XY),HRM分析FGFR3基因第7外顯子顯示存在堿基變異,但非c.742C＞T突變,其HRM 熔解曲線與c.742C＞T雜合突變陽(yáng)性對(duì)照樣本和野生型樣本的熔解曲線都明顯區(qū)分開(圖2B)。推測(cè)其為第7外顯子上另一種較常見(jiàn)的c.746 C＞G(p.S249C)雜合突變。結(jié)果被基因測(cè)序證實(shí)(圖3A)。

圖3 FGFR3基因第7外顯子測(cè)序結(jié)果

4 討論

既往研究已證實(shí)FGFR3基因的突變與致死性骨發(fā)育不良I型的發(fā)生密切相關(guān)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(fibroblast grow th factor receptor s3,FGFR3)屬酪氨酸激酶受體家族,是一種發(fā)育調(diào)節(jié)跨膜受體。人類FGFR3基因位于4p16.3,包括19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子,共16.5 kb,FGFR3蛋白由3個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白樣的FGF結(jié)合域(IgⅠ,IgⅡ,IgⅢ)、跨膜區(qū)(TM)和2個(gè)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)(TK 1和TK 2)組成。人類FGFR3基因的突變會(huì)引起一系列骨骼發(fā)育缺陷性疾病,如軟骨發(fā)育不全(achond roplasia,ACH)、軟骨發(fā)育低下(hypochond rop lasia,HCH)和 TD等。TDⅠ患者中已發(fā)現(xiàn)多種不同的點(diǎn)突變類型,大多數(shù)為單個(gè)氨基酸突變成Cys,突變分部于FGFR3基因3種不同的結(jié)構(gòu)域,主要集中在IgⅡ和IgⅢ結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)(A rg248Cys和 Ser249Cys)、近膜區(qū)(Gly370Cys、Ser371Cys和Tyr373Cys)和羧基端(stop807Gly、stop807Cys和 stop807A rg)[5]。其中,73%的TDⅠ是由p.R248C、p.S249C和 p.Y373C 3種錯(cuò)義突變所致[6]。

本研究對(duì)2例超聲發(fā)現(xiàn)疑為TDI的胎兒進(jìn)行快速診斷,采用HRM技術(shù)檢測(cè)FGFR3基因第7外顯子p.248突變熱區(qū)。病例1羊水樣本的H RM熔解曲線與p.R248C陽(yáng)性對(duì)照樣本一致,診斷為TD I;病例2臍血樣本的H RM熔解曲線與野生型和p.R248C陽(yáng)性對(duì)照樣本的熔解曲線均不同,考慮該患兒FGFR3基因第7外顯子存在突變,但并非最常見(jiàn)的 p.R248C,可能為該區(qū)域另一常見(jiàn)突變 p.S249C。直接測(cè)序檢測(cè)FGFR3基因第7外顯子,證實(shí)為p.S249C雜合突變。在以前的研究中我們報(bào)告了中國(guó)人TD I病例幾乎均為p.R248C突變[7],此例p.S249C突變?yōu)閲?guó)內(nèi)首次報(bào)道,也進(jìn)一步證實(shí)了HRM是一種快速、簡(jiǎn)便、高敏感性和高特異性的分子診斷方法。

對(duì)產(chǎn)前超聲檢查疑為 TD I的病例,產(chǎn)前取材排除染色體疾病的同時(shí)應(yīng)行基因檢查。應(yīng)用H RM分析法基因檢測(cè)FGFR3基因的常見(jiàn)突變,可快速明確診斷,產(chǎn)前取材后24小時(shí)內(nèi)即可得出診斷報(bào)告。確診者在臨床可及時(shí)終止妊娠,減輕孕婦等待結(jié)果的精神壓力和晚期引產(chǎn)的不良影響,并有助于疾病再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的遺傳咨詢。

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