廖明陽，劉華鋼

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530021)

納米藥物既是國際科學(xué)前沿，也是與人類健康和生活密切相關(guān)的重要社會(huì)問題，充滿了創(chuàng)新的機(jī)遇。與傳統(tǒng)分子藥物相比納米藥物的最大優(yōu)點(diǎn)在于，納米藥物利用納米顆粒的小尺寸效應(yīng)、容易進(jìn)入細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)高療效;納米藥物的比表面積大、鏈接或載帶的功能基團(tuán)或活性中心多，可以實(shí)現(xiàn)治療與療效跟蹤同步化;材料的性能優(yōu)越，便于生物降解或吸收;納米具有的多孔、中空、多層等結(jié)構(gòu)特性，易于藥物緩釋控制等［1］。但納米藥物作為運(yùn)用納米技術(shù)(特別是納米化制備技術(shù))研究開發(fā)的一類新的藥物制劑，在呈現(xiàn)誘人的納米生物效應(yīng)的同時(shí)，其安全性問題也不容忽視。納米銅是代表性的金屬納米材料之一，已經(jīng)作為商業(yè)化產(chǎn)品進(jìn)入市場多年。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中有望代替銅化合物或微米銅材料應(yīng)用到畜類飼料添加劑［2］、抗骨質(zhì)疏松及抗衰老的納米藥物和宮內(nèi)節(jié)育器等方面［3］。在前期研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)納米銅能夠引起大鼠腎臟的毒性損害［4～6］，本研究中我們進(jìn)一步利用體外腎細(xì)胞模型，探討氧化應(yīng)激在納米銅引起腎細(xì)胞毒性中的作用。

1 材料與方法

1.1材料納米級銅粉，購自深圳尊業(yè)納米有限公司;人近端腎小管上皮細(xì)胞系(HK-2)為本室保存。谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和超氧化物酶(SOD)測定試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.2納米銅分散方法將準(zhǔn)確稱重的納米銅粒子加入試驗(yàn)用培養(yǎng)基中制成母液(終濃度10 g·L-1)，物理混勻，采用水浴超聲分散30 min，結(jié)束后立即取適量稀釋為試驗(yàn)所用濃度。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在含 10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)傳代。細(xì)胞生長至85%～90%融合時(shí)，分別給予不同濃度的納米銅處理，設(shè)對照組。

1.4細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測采用熒光探針DCFH-DA標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成。熒光染料DCFH-DA能自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，被酯酶水解成DCFH，有活性氧存在時(shí)刻被氧化成DCF，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量呈正相關(guān)。分別收集納米銅作用2、24 h的貼壁細(xì)胞，PBS輕洗3次，細(xì)胞重懸于0.5 ml PBS，取儲(chǔ)存于 -20℃、溶于 DMSO的 DCFH-DA儲(chǔ)存液 (1 mmol·L-1)2.5 μl加入到細(xì)胞懸液中，終濃度為5 μmol·L-1，37℃ 孵育 30 min，用 PBS 漂洗 3 次，0.5 ml PBS重懸，立即用流式細(xì)胞儀測定DCFH-DA反應(yīng)后細(xì)胞內(nèi)DCF的平均熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長448 nm，發(fā)射波長526 nm，每份樣品計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞。

1.5細(xì)胞內(nèi)金屬硫蛋白表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)法測定。將5×104細(xì)胞接種于預(yù)先置玻片的24孔板中培養(yǎng)24 h，此后加入不同濃度的納米銅懸浮液培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)上清，PBS輕洗細(xì)胞2次后，用95%乙醇固定30 min，晾干，加入PBS作用5 min，取出玻片，濾紙輕吸干外周水分，滴加合適量的抗金屬硫蛋白抗體(1∶100稀釋)，采用PV二步染色法，操作按照試劑說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，結(jié)束后中性樹脂封片照像，每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對照。

1.6氧化應(yīng)激指標(biāo)測定細(xì)胞生長在6孔板或者25 cm2的培養(yǎng)瓶中，分別加入納米銅懸浮液作用24 h，經(jīng)胰酶消化，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液處理，離心取上清測定下列指標(biāo)。培養(yǎng)上清則直接離心棄沉淀測定相關(guān)指標(biāo)。測定方法嚴(yán)格按照試劑說明書執(zhí)行，測定原理簡介如下。

1.6.1谷胱甘肽測定 二硫代二硝基苯甲酸與巰基化合物反應(yīng)時(shí)能生成一種黃色化合物，412 nm進(jìn)行比色定量測定。

1.6.2MDA測定 過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。

1.6.3銅鋅超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應(yīng)體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，可通過比色法定量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用±s表示，利用SPSS10.0軟件進(jìn)行單因素的ANOVA分析，先作方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊再進(jìn)行單因素多水平方差分析，各組間比較采用Dunnett’t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1納米銅粒子氧化能力分析將0～40 mg·L-1納米銅與HK-2細(xì)胞作用2、24 h，測定細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成量，結(jié)果見Fig 1。由圖可知，納米銅可以劑量依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高。

Fig 1 The changes of ROS generation in HK-2 cells after nano-copper exposed(n=3)

2.2納米銅對細(xì)胞金屬硫蛋白(metallothinein，MT)表達(dá)的影響金屬硫蛋白是細(xì)胞對金屬作用的一種應(yīng)激性反應(yīng)，免疫細(xì)胞化學(xué)法分析結(jié)果顯示20 mg·L-1納米銅與細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)均明顯增強(qiáng)，結(jié)果見Fig 2，可見MT主要分布在細(xì)胞漿，呈棕黃色顆粒物。

Fig 2 The changes of the expression of metallothionein in cell after nano-copper exposed HK-2 cells

2.3納米銅對氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響將0～40 mg·L-1納米銅與HK-2細(xì)胞作用24 h，測定細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，結(jié)果見Tab 1，可見細(xì)胞內(nèi)GSH，培養(yǎng)上清中的MDA水平均呈劑量依賴性升高，而細(xì)胞內(nèi) MDA、CuZn-SOD水平升高不明顯。

Tab 1 Indicators of oxdative stress measured after nano-copper 24 h exposed(±s，n=3)

Tab 1 Indicators of oxdative stress measured after nano-copper 24 h exposed(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Nano-copper Concentration/mg·L-1 Supernatant MDA/μmol·L-1 Cell MDA/μmol·g-1Pro GSH/mg·g-1Pro CuZn-SOD/kU·g-1Pro 0 1.18±0.26 1.58±0.54 27.81±0.60 2.09±0.37 5 1.76±0.19 1.73±0.38 34.27±4.08 2.17±0.53 10 1.99±0.21* 1.79±0.25 43.73±14.10* 2.31±0.58 20 2.46±0.35＊＊ 1.72±0.27 47.83±11.37* 2.06±0.63 40 2.39±0.47＊＊ 2.09±0.13 52.60±4.48*2.20±0.71

3 討論

目前，國內(nèi)外對納米銅的生物安全性及其機(jī)制已經(jīng)展開了初步的探討，結(jié)果顯示無論是對人或生態(tài)系統(tǒng)，納米銅潛在的毒性均不容忽視［7～9］。由于納米材料具有小尺寸-大比表面積的特性，因此，普遍認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是納米材料引起毒性損傷的重要機(jī)制之一。在腎臟，腎近端小管上皮細(xì)胞因?yàn)槠涮厥獾慕Y(jié)構(gòu)和功能成為外源性化合物誘導(dǎo)腎毒性過程中的敏感靶位點(diǎn)，腎小管上皮細(xì)胞已經(jīng)成為研究化合物腎毒性的可靠細(xì)胞模型。本研究中我們利用人近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)觀察了氧化應(yīng)激作用在納米銅引起腎細(xì)胞損傷中的作用。

活性氧是一系列化學(xué)性質(zhì)活潑、氧化能力強(qiáng)的含氧物質(zhì)的總稱。它是由氧直接或間接轉(zhuǎn)變的氧自由基及其衍生物，包括氧的單電子反應(yīng)產(chǎn)物、H、H2O2·OH-及其衍生物1O2及膜質(zhì)過氧化中間產(chǎn)物L(fēng)O·、LOO·、LOOH等比分子氧活潑的物質(zhì)［10］。生物體內(nèi)活性氧的生成與清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，當(dāng)各種因素打破這一平衡而導(dǎo)致活性氧濃度超過生理限度時(shí)就會(huì)損傷生物大分子，包括脂質(zhì)過氧化、DNA的氧化損傷、蛋白質(zhì)的氧化和單糖氧化等，從而導(dǎo)致各種疾病發(fā)生。本研究中發(fā)現(xiàn)納米銅可以劑量依賴性方式誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高，提示細(xì)胞內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生偏移。

金屬硫蛋白是一類低分子量，富含半胱氨酸的金屬結(jié)合蛋白，普遍存在于真核細(xì)胞中，它是肝、腎細(xì)胞內(nèi)主要的銅結(jié)合蛋白，對銅有高親合力(7～10 g atoms/mol)。主要負(fù)責(zé)螯合細(xì)胞內(nèi)游離的銅離子。隨著人類對金屬硫蛋白的了解逐漸深入，其在機(jī)體內(nèi)的基本功能已經(jīng)達(dá)到共識(shí):清除自由基、抗擊電離輻射的作用、重金屬的解毒作用、參與微量元素的代謝、參與機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)、增強(qiáng)機(jī)體對抗不良狀態(tài)的適應(yīng)能力、影響 DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)的合成，抗細(xì)胞凋亡作用等［11］。本研究利用免疫細(xì)胞化學(xué)法分析發(fā)現(xiàn)，20 mg·L-1納米銅與細(xì)胞作用24 h，細(xì)胞內(nèi)MT表達(dá)均明顯增強(qiáng)，這是細(xì)胞的一種應(yīng)激性保護(hù)反應(yīng)，提示納米銅暴露后細(xì)胞內(nèi)銅離子以及活性氧含量的增加。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，納米銅引起細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)MDA含量升高，提示細(xì)胞的脂質(zhì)成分發(fā)生了氧化改變，證實(shí)了納米銅引起的細(xì)胞損傷與其產(chǎn)生的自由基的氧化損傷作用有關(guān)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，其水平高低代表脂質(zhì)過氧化強(qiáng)度和速率，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)是發(fā)生在多聚不飽和脂肪酸上的系列自由基反應(yīng)。脂質(zhì)過氧化是氧自由基造成組織細(xì)胞損傷的主要途徑之一，測定脂質(zhì)過氧化發(fā)生的程度，可作為判斷自由基致細(xì)胞損傷的一個(gè)指標(biāo)。

谷胱甘肽(GSH)是組織細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物，GSH可清除超氧陰離子、H2O2等自由基，以保護(hù)含巰基的酶和蛋白質(zhì)免受氧化損傷［12］。SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，其活性高低與機(jī)體抗氧化損傷能力相關(guān)［13］。本研究中發(fā)現(xiàn)，作為一種代償性反應(yīng)，納米銅暴露后細(xì)胞內(nèi)GSH和SOD含量升高，但并不足以抵抗納米銅引起的活性氧等自由基增加，最終仍表現(xiàn)出細(xì)胞的氧化損傷。

綜上所述，納米銅在一定劑量和暴露時(shí)間條件下確實(shí)破壞了腎細(xì)胞內(nèi)活性氧與抗氧化物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，引起氧化應(yīng)激，這可能與納米銅引起的毒性損傷有關(guān)。

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