薛生國，王鈞，劉恒，雷杰，劉豐豪

(中南大學(xué) 冶金科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙，410083)

重金屬具有不可降解性和持久性，通過食物鏈積累在動植物體內(nèi)，對生物和人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。隨著人們環(huán)保意識的增強，錳在冶金、陶瓷、玻璃、電池、防腐材料、汽油防爆劑和農(nóng)藥等方面廣泛使用以及對錳礦開采引起的土壤、地表水和地下水的Mn2+污染日益得到關(guān)注[1-3]。具有超富集特性的耐性植物清除土壤和水體環(huán)境中的金屬和類金屬污染-植物修復(fù)技術(shù)(Phytoremediation)具有潛在的高效、廉價及其環(huán)境友好性，通過種植收割這類植物可有效地治理環(huán)境中的重金屬污染[4]。植物對重金屬的耐性可通過金屬排斥(Metal exclusion)和金屬積累(Metal accumulation)這2條途徑進(jìn)行。金屬排斥是指重金屬被植物吸收后又排出體外，或者重金屬在植物體內(nèi)的運輸受到阻礙；金屬積累是指重金屬在植物體內(nèi)以不具有生物活性的解毒形態(tài)存在[5]。超積累植物是一種極端的金屬積累型植物，因其超尋常的重金屬積累能力而被廣泛應(yīng)用于污染環(huán)境修復(fù)研究[6-10]。研究不同Mn2+處理條件下商陸不同組織器官化學(xué)組成上的差異將有助于揭示其Mn2+耐性機理。紅外光譜中反映的是植物中混合成分的疊加，各種化學(xué)成分只要質(zhì)和量相對穩(wěn)定，樣品的處理方法按統(tǒng)一要求進(jìn)行，則其紅外光譜是相對穩(wěn)定的。任立民等[11]利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)研究垂序商陸對錳毒生理響應(yīng)。在此，本文作者利用FTIR對商陸不同組織器官的化學(xué)組成進(jìn)行研究，以期為Mn2+污染環(huán)境修復(fù)和Mn2+耐性機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗方法

將商陸種子播于濕沙，萌芽后依次在 0.25 Hoagland營養(yǎng)液和0.50 Hoagland營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)15 d，選擇生長一致的商陸幼苗移至外壁不透光的塑料容器。Mn2+濃度設(shè)定為7種，分別為0.005，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0和10.0 mmol/L。Mn以MnCl2的形式加入，每個實驗重復(fù)3次。每4 d換1次營養(yǎng)液，保持連續(xù)通氣。植物在35 d后收獲，用去離子水洗凈，稱質(zhì)量，分別取根、莖、葉3部分于105 ℃殺青30 min，然后于75 ℃烘箱中干燥48 h，用不銹鋼粉碎機粉碎，過75 μm篩。

1.2 傅里葉紅外光譜分析

按照所給定的測試條件(光譜范圍 為 500～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描累加次數(shù)為32次)，采用美國Nicolet公司制造的Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀對商陸根、莖和葉的粉末樣品進(jìn)行測定。應(yīng)用OMNI采樣器直接測定紅外光譜，并采用OMNIVE.S.P 5.1同步智能軟件對圖譜進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 根的FTIR分析

不同 Mn2+濃度下商陸根系的傅里葉紅外光譜見圖1，商陸根系的特征峰見圖2。從圖1可見：3 420 cm-1處附近的峰是分子間氫鍵O—H自由羥基的伸縮振動峰，主要來自于纖維素、半纖維素、多糖等碳水化合物[12]；隨著Mn2+濃度的升高，吸收峰移向低頻3 390 cm-1，同時峰形變窄。從圖2可見：在Mn2+濃度低于1.0 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的升高，吸光度先上升后下降，說明低濃度Mn2+促進(jìn)了商陸根部碳水化合物的分泌；同時，隨著Mn2+濃度的升高，根外表皮細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Mn2+形成穩(wěn)定的化合物，使細(xì)胞表面的氫鍵減少；當(dāng)Mn2+濃度大于2.0 mmol/L時，峰值再次出現(xiàn)上升的變化趨勢，說明高濃度Mn2+可能破壞了根外表皮細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Mn2+的機制，導(dǎo)致根外表皮細(xì)胞壁的羥基無法吸附結(jié)合Mn2+，引起峰值升高。

圖1 不同Mn2+濃度條件下商陸根系的傅里葉紅外光譜圖Fig.1 Absorption FTIR spectra in roots of P. acinosa in different Mn2+ concentrations

2 926 cm-1左右的吸收峰是飽和C—H鍵的伸縮振動吸收峰，主要來自于細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)、纖維素和果膠等組織成分(圖1)。當(dāng)Mn2+濃度小于1.0 mmol/L時，隨著 Mn2+濃度的增加，吸光度先升后降(圖 2)；商陸的根部由于耐性機制不斷分泌有機酸螯合Mn2+，但是，前期 Mn2+處理濃度較低，螯合 Mn2+的有機酸消耗速率小于根部的有機酸分泌速率，導(dǎo)致羧酸頻帶上升；隨著 Mn2+濃度的增加，螯合 Mn2+的有機酸消耗速率大于根部的有機酸產(chǎn)生速率，羧酸頻帶又開始下降；當(dāng)Mn2+濃度大于1.0 mmol/L時，隨著Mn2+毒害的進(jìn)一步加重，其羧酸螯合力變?nèi)酰蚨漕l帶上升。

圖2 不同Mn2+濃度下商陸根系的特征峰變化圖Fig.2 Band height changes in roots of P. acinosa in different Mn2+ concentrations

1 735～1 720 cm-1處的峰為脂肪族酮類化合物中羰基的C=O伸縮振動峰。在1 735 cm-1附近，隨著Mn2+濃度的升高，前期峰值降低，但最高濃度處理下，開始出現(xiàn)顯著吸收峰，峰值達(dá)到最大(圖2)。這可能是因為初期商陸膜質(zhì)過氧化，使脂類物質(zhì)減少，但含脂肪族酮類化合物中羰基的產(chǎn)物也逐漸增多，因而后期開始升高。

1 380 cm-1附近的吸收帶是含油脂化合物(各種膜和胞壁)的組織中甲基的吸收帶。在 Mn2+濃度為 0.2 mmol/L時，峰值小幅度上升，可能是由于低濃度Mn2+促進(jìn)了商陸根部含油脂化合物的分泌。但是，在Mn2+濃度大于0.2 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的進(jìn)一步增大，其峰值表現(xiàn)先減小后增大， 峰形也出現(xiàn)多向短波位移(見圖 1)，這也說明隨著 Mn2+濃度的升高，細(xì)胞壁通過降低果膠甲基化程度，使CEC(陽離子交換能力)增強，進(jìn)而吸收更多的 Mn2+，即通過細(xì)胞壁中積累Mn2+來增強抗逆性，但高濃度的Mn2+已對商陸產(chǎn)生了脅迫，甲基化程度又開始升高。

1 060 cm-1附近吸收峰為碳水化合物(醇、醚基、酯基或酚)的 C—O 基團(tuán)的伸縮振動峰(圖 1)[12]。當(dāng)Mn2+濃度小于0.5 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的升高，吸光度先升后降，說明低濃度Mn2+促進(jìn)該類物質(zhì)的合成，也可能是由于化學(xué)吸附羥基與Mn2+作用，導(dǎo)致C—O峰值增加；當(dāng)Mn2+濃度升高時，糖類運輸通道受到一定影響，致使部分糖類物質(zhì)無法運輸?shù)礁?；?dāng)Mn2+濃度大于0.5 mmol/L時，膜過氧化機制對峰值變化起主導(dǎo)作用；隨著Mn2+濃度的升高，膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物在根部積累，引起峰值升高；而在Mn2+濃度為10.0 mmol/L時，高濃度的Mn2+破壞了此機制，造成脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物減少，峰值下降[13-15]。

2.2 莖的FTIR分析

圖3 不同Mn2+濃度下商陸莖的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 Absorption FTIR spectra in stems of P. acinosa. in different Mn2+ concentrations

圖4 不同Mn2+濃度下商陸莖的特征峰變化圖Fig.4 Band height changes in stems of P. acinosa in different Mn2+ concentrations

不同 Mn2+濃度下商徑根的傅里葉紅外光譜和特征峰分別見圖3和圖4。從圖3可見：當(dāng)Mn2+濃度小于1.0 mmol/L時，3 420 cm-1附近吸收峰的峰值無明顯變化，說明商陸莖中碳水化合物成分沒有明顯變化，這也表明當(dāng)Mn2+濃度大于1.0 mmol/L時，在外部Mn2+的脅迫下，商陸莖中的生理過程受影響程度較小，也表現(xiàn)出商陸對 Mn2+的耐性特征。而隨著 Mn2+濃度的升高，該峰的吸光度先升后降。這說明后期Mn2+濃度的升高，促進(jìn)了有機物的分泌和運輸，通過滲透作用來增強莖對 Mn2+的抗逆性，但在 Mn2+濃度為 10.0 mmol/L時，Mn2+的毒性加劇，莖細(xì)胞的細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Mn2+，使細(xì)胞表面的氫鍵減少，引起峰值下降。

由圖3可以看出：2 926 cm-1附近吸收峰峰形未發(fā)生明顯位移，肩峰變化不大。隨著Mn2+濃度的增加，吸光度前期變化不大，當(dāng)Mn2+濃度為2.0 mmol/L時，有輕微升高與下降(圖4)。這說明當(dāng)Mn2+濃度低于2.0 mmol/L時，低濃度Mn2+對商陸莖的運輸功能影響不大，在5.0 mmol/L時，反而促進(jìn)商陸產(chǎn)生碳水化合物等物質(zhì)增強其 Mn2+耐性；但當(dāng) Mn2+濃度為 10.0 mmol/L時，已影響碳水化合物等的合成和運輸。

由圖 4可以看出：隨著 Mn2+濃度的升高，前期1 735～1 720 cm-1處的吸收峰峰值無明顯變化，但在Mn2+濃度為5.0 mmol/L時，出現(xiàn)顯著吸收峰，峰值達(dá)到最大；而當(dāng)Mn2+濃度為10.0 mmol/L時，峰值下降。這可能是因為在一定 Mn2+濃度的刺激下會產(chǎn)生脂肪族酮類化合物等物質(zhì)，通過滲透調(diào)節(jié)來增強抗逆性，但隨著Mn2+毒的加劇，脂肪族酮類化合物等物質(zhì)合成減少，峰值下降。

隨著Mn2+濃度的升高，1 380 cm-1附近吸收峰的峰值先下降后上升，在當(dāng)Mn2+濃度為10.0 mmol/L時，峰值再次出現(xiàn)下降(圖 4)。這可能是因為隨著 Mn2+濃度的升高，細(xì)胞壁通過降低果膠甲基化程度，使CEC(陽離子交換能力)增強，進(jìn)而吸收更多的Mn2+，即通過細(xì)胞壁中累積Mn2+來增強抗逆性，但高濃度的Mn2+已對商陸產(chǎn)生了脅迫，甲基化程度又開始升高，關(guān)于在Mn2+濃度為10.0 mmol/L處峰值下降的原因有待進(jìn)一步研究。

由圖3看出：隨著Mn2+濃度的升高，1 060 cm-1處的最大吸收帶由對照的 1 060 cm-1位移到 1 052 cm-1附近，但峰形變化不大，肩峰變化不明顯；當(dāng)Mn2+濃度小于1.0 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的升高，吸光度變化不大；但當(dāng)Mn2+濃度為5.0 mmol/L時，出現(xiàn)顯著吸收峰，峰值達(dá)到最大；而當(dāng) Mn2+濃度為10.0 mmol/L時，峰值下降；當(dāng) Mn2+濃度為 2.0～5.0 mmol/L時，膜過氧化機制對峰值變化起主導(dǎo)作用，隨著Mn2+濃度的升高，膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物在根部積累，引起峰值升高。而在Mn2+濃度為10.0 mmol/L時，高濃度的Mn2+可能破壞了此機制，造成脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物減少，引起峰值下降[13-15]。

2.3 葉的FTIR分析

Mn2+濃度不同時商陸葉的紅外光譜和特征峰分別見圖5和圖6。從圖5可見：當(dāng)Mn2+濃度低于1.0 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的升高，3 420 cm-1附近吸收峰的峰值下降，說明葉片表皮細(xì)胞壁的羥基吸附結(jié)合Mn2+，使細(xì)胞表面的氫鍵減少(圖6)；而當(dāng)Mn2+濃度達(dá)到2.0 mmol/L時，吸光度上升，說明后期Mn2+濃度的升高，促進(jìn)了有機物的分泌和運輸，通過滲透作用來增強莖對 Mn2+的抗逆性，同時高濃度的 Mn2+阻礙了這些有機物的合成和運輸。

2 926 cm-1處吸收峰為羧酸O—H與甲基C—H鍵的伸縮振動重疊，主要來自于維生素和各種膜及細(xì)胞壁的組織成分等[12](圖5)，這與運輸功能有關(guān)。該處峰的峰值隨著 Mn2+濃度增加先升高后下降(圖 6)，表明說明前期商陸分泌的有機酸不斷螯合 Mn2+，造成羧酸O—H 的減少，隨著Mn2+毒害的加重，其羧酸螯合力變?nèi)酢?/p>

在低外源Mn條件下，1 650～1 620 cm-1處的峰值在處理前期下降，說明隨著Mn2+濃度的升高，蛋白二級結(jié)構(gòu)中，肽鍵間氫鍵的結(jié)合力隨著Mn2+濃度的升高而變?nèi)?圖6)。而在Mn2+濃度為2.0 mmol/L時，出現(xiàn)顯著吸收峰，可能是由于不斷增加的Mn2+誘導(dǎo)富脯氨酸蛋白、病害相關(guān)蛋白和富甘氨酸蛋白等一些蛋白合成，Didierjean等[16]還認(rèn)為這些重金屬脅迫誘導(dǎo)蛋白可能具有保護(hù)植物細(xì)胞免受重金屬毒害的作用，出現(xiàn)的顯著吸收峰可能與商陸葉中氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量升高有關(guān)。當(dāng) Mn2+濃度為 5.0和 10.0 mmol/L時，吸光度下降，可能是高濃度的Mn2+毒破壞了重金屬脅迫誘導(dǎo)蛋白合成機制所致。

圖5 不同Mn2+濃度下商陸葉的傅里葉紅外光譜圖Fig.5 Absorption FTIR spectra in leaves of P. acinosa in different Mn2+ concentrations

圖6 不同Mn2+濃度下商陸葉的特征峰變化圖Fig.6 Band height changes in leaves of P. acinosa in different Mn2+ concentrations

隨著Mn2+濃度的升高，1 380 cm-1附近的峰值表現(xiàn)先降后升的趨勢，但在Mn2+濃度為2.0 mmol/L時，又出現(xiàn)輕微下降。這說明隨著Mn2+濃度的增大，細(xì)胞壁通過降低果膠甲基化程度，進(jìn)而吸收更多的Mn2+，即通過細(xì)胞壁中積累Mn2+來增強抗逆性，但高濃度的Mn2+對商陸產(chǎn)生了脅迫，甲基化程度又開始升高；當(dāng)Mn2+濃度為2.0 mmol/L時，又出現(xiàn)輕微下降的原因可能是高濃度的Mn2+抑制了細(xì)胞內(nèi)含油脂化合物產(chǎn)生。

從圖5可見：在Mn2+濃度小于1.0 mmol/L時，隨著Mn2+濃度的升高，1 060 cm-1附近吸收峰的峰值下降，說明當(dāng)Mn2+濃度升高時，該類物質(zhì)的運輸受到影響，峰值降低；在Mn2+濃度大于1.0 mmol/L時峰值上升，可能是膜過氧化程度加深，脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物在葉部積累，引起峰值升高；而在Mn2+濃度為5.0和10.0 mmol/L時，高濃度的Mn2+破壞了此機制，造成脂肪族酮類化合物過氧化產(chǎn)物減少，峰值下降[13-15]。

3 結(jié)論

(1) 糖類和氨基酸等有機化合物在低Mn2+處理條件下往往作為滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)出現(xiàn)，其含量升高，隨著Mn2+毒害的加重，其合成和運輸都會受限，含量必然下降，這在輸導(dǎo)組織中表現(xiàn)明顯。當(dāng) Mn2+濃度為0.2 mmol/L時，根在2 926 cm-1處的峰值先減弱后增強, 說明商陸分泌的有機酸不斷螯合Mn2+，造成羧酸O—H減少；隨著Mn2+毒害的加重，其羧酸螯合能力變?nèi)?；?dāng)Mn2+濃度為2.0 mmol/L時，葉在1 640 cm-1處的顯著吸收峰可能與商陸葉中氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量升高有關(guān)，或與根部輸送的羧酸鹽過多有關(guān)，且與根部此處峰值的下降趨勢吻合。

(2) 商陸對Mn2+毒的耐性存在一個臨界值，當(dāng)超過此臨界值時，植物同樣會受到毒害，主要表現(xiàn)是膜脂過氧化。根、莖、葉在1 060 cm-1處峰值的變化均證明了這一點。

(3) 商陸根、莖、葉組織中糖類、氨基酸和有機酸等物質(zhì)含量隨Mn2+濃度升高而變化較大，而莖組織各物質(zhì)含量變化不大，表明當(dāng) Mn2+濃度小于 2.0 mmol/L的外部Mn2+脅迫下，商陸莖組織中的生理過程受影響較小，有機物的合成和運輸基本沒有受到影響，也表明商陸具有較強的Mn2+耐性特征。

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