柴燕玲，杜俊毅，張 濤，牛小群，吳文娟，曹 宇

（昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，云南 昆明 650101）

肺纖維化是一種發(fā)病隱匿、進(jìn)展迅速、病死率高，且治療效果欠佳的慢性肺部疾患。以肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞）、纖維母細(xì)胞增生和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix,ECM）進(jìn)行性沉積為主要特征。本研究利用博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，觀察LMWH對(duì)大鼠肺組織中TGF-β1水平變化的影響，并與地塞米松作比較，探討LMWH對(duì)肺纖維化的保護(hù)作用。

材料和方法

一、材料和試劑 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，體重220～260g，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。注射用鹽酸博來霉素粉劑（日本化藥株式會(huì)社，15mg/支，批號(hào)191130），10%水合氯醛（昆明醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供），低分子量肝素鈉（昆明積大制藥有限公司，批號(hào)080501），地塞米松（山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)0907041），大鼠TGF-β1 ELISA試劑盒 （Santa Cruz），兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體（Santa Cruz），第2代通用型二步法檢測(cè)系統(tǒng)（pv-9000）（北京中杉金橋），羥脯氨酸堿水法測(cè)試盒（南京建成生物工程研究所）。

二、方法 1.模型的建立和分組：將動(dòng)物隨機(jī)分配分成4組，每組25只。健康對(duì)照組，參照Szapiel等[1]的方法氣管內(nèi)注入生理鹽水代替博來霉素。肺纖維化模型組，氣管內(nèi)注入博來霉素（按5 mg/kg比例溶于0.2～0.3ml生理鹽水中）。地塞米松干預(yù)組，造模當(dāng)日予以每日地塞米松腹腔注射（1 mg/kg）。LMWH干預(yù)組，造模當(dāng)日起開始每天給予低分子肝素1000單位肌肉注射。各組隨機(jī)分別于造模后第1，3，7，14及28d各處死大鼠5只。

2.肺組織標(biāo)本制備：各組大鼠予以10%水合氯醛（3.8ml/kg）腹腔注射麻醉，剪開腹腔，腹主動(dòng)脈采血，剪開胸腔，分離氣管和肺臟，右側(cè)肺臟用手術(shù)縫合線結(jié)扎，左肺行支氣管肺泡灌洗術(shù)（參照史菲等[2]的方法）。BALF存于-80℃保存，供測(cè)TGF-β1用。取右肺下葉10%福爾馬林溶液內(nèi)固定后放入10%福爾馬林溶液內(nèi)固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，行TGF-β1免疫組化檢查；右肺上葉保存于-70℃低溫冰箱，用堿水解法檢測(cè)羥脯氨酸含量。

3.TGF-β1的檢測(cè)：ELISA法檢測(cè)BALF中TGF-β1蛋白量，根據(jù)試劑盒提供的方法進(jìn)行反應(yīng)，終止反應(yīng)后用酶聯(lián)儀測(cè)492nm光密度（OD），結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較確定TGF-β1含量。

4.免疫組化檢測(cè)肺組織TGF-β1：常規(guī)脫蠟、水化、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；抗原修復(fù)；5%BSA封閉；一抗，兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體1∶300（抗體為胞漿表達(dá)）；二抗，辣根酶標(biāo)記羊抗兔IgG多聚體；DAB顯色；常規(guī)蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片。免疫組化染色結(jié)果應(yīng)用HP1000彩色圖文病理分析系統(tǒng)（湖北千屏影像有限公司）進(jìn)行分析，將肺組織各時(shí)點(diǎn)切片隨機(jī)取染色區(qū)域5個(gè)高倍視野（×400），測(cè)量并記錄每個(gè)視野陽(yáng)性染色的平均積分光密度（IOD）值。

5.肺組織羥脯氨酸測(cè)定（堿水法）：羥脯氨酸的測(cè)定采用南京建成生物技術(shù)公司的堿水解試劑盒，按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以表示，采用單因素方差分析方法，組間差別采用SNK檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠肺組織大體觀察 對(duì)照組大鼠肺組織呈粉紅色，表面光滑有光澤，質(zhì)地柔軟，彈性良好。模型組大鼠肺組織顏色暗紅，彈性降低，質(zhì)地較硬，肺葉腫脹，早期雙肺葉可見散在出血病灶，后期雙肺組織出現(xiàn)灰白色的小結(jié)節(jié)。2個(gè)干預(yù)組肺組織腫脹程度較模型組為輕，早期亦可見肺葉出血病灶，但后期肺組織灰白色小結(jié)節(jié)較少。

二、肺組織TGF-β1的表達(dá) TGF-β1主要表達(dá)在胞漿，主要表達(dá)的細(xì)胞有肺泡巨噬細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、支氣管粘膜上皮細(xì)胞。TGF-β1在對(duì)照組肺組織均為弱表達(dá)。模型組和干預(yù)組的TGF-β1表達(dá)較對(duì)照組有明顯增加（P＜0.05）。干預(yù)組TGF-β1表達(dá)均較模型組降低（P＜0.05），其中LMWH組第28d TGF-β1表達(dá)地塞米松組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

三、血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量變化 第7、14、28d模型組和干預(yù)組的血清TGF-β1含量較對(duì)照組有明顯增加（P＜0.05），干預(yù)組TGF-β1表達(dá)均較模型組降低（P＜0.05），其中LMWH組第14d TGF-β1表達(dá)較地塞米松組顯著降低（P＜0.05）。BALF的TGF-β1含量變化與血清一致。結(jié)果見表2。

四、肺組織羥脯氨酸的變化 氣管內(nèi)滴入博來霉素后，模型組肺組織羥脯氨酸含量明顯升高（P＜0.05），采用地塞米松和LMWH治療后明顯降低（P＜0.05），與模型組相比，地塞米松和LMWH均明顯降低HYP的含量（P＜0.05），且LMWH的作用較地塞米松更為顯著（第28d，P＜0.05）。如表3所示。

討 論

肺纖維化是一種以間質(zhì)纖維化及肺臟毀損為特征的疾病，是多種彌漫性肺間質(zhì)疾病的最終轉(zhuǎn)歸。其發(fā)病機(jī)制仍不十分明確，目前尚無(wú)特效藥物治療，臨床預(yù)后差。本研究采用肺纖維化的最經(jīng)典博來霉素大鼠損傷模型[3,4]，來研究LMWH對(duì)肺間質(zhì)纖維化的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制。

表1 肺組織 TGF-β1 的表達(dá) （，n=5）

表1 肺組織 TGF-β1 的表達(dá) （，n=5）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d3d7d14d 28d正常對(duì)照組26.13±3.8526.28±5.4226.72±5.0627.55±4.69 28.04±2.58模型組26.18±3.4332.41±4.2465.24±5.14*85.45±5.53* 121.06±9.56*地塞米松組26.42±3.6531.85±2.9349.44±5.10*75.56±5.50*△ 97.69±9.28*△低分子肝素組27.07±3.8532.23±3.4647.91±4.95*73.15±6.50*△ 88.92±6.13*△▲

表2 各組血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量的比較（，pg/ml，n=5）

表2 各組血清及肺泡灌洗液TGF-β1含量的比較（，pg/ml，n=5）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d 3d 7d 14d 28d血清正常對(duì)照組169.52±12.98172.21±28.83176.72±29.10185.84±15.98 198.74±14.43模型組174.87±30.48201.61±29.11357.66±36.16*410.03±45.16* 510.65±60.99*地塞米松組 181.00±20.49 182.90±43.68 256.35±50.89*△ 359.51±53.97*△ 403.64±40.57*△低分子肝素組 179.18±23.29 199.41±32.86 265.08±45.19*△ 313.41±34.42*△▲ 368.76±39.60*△BALF正常對(duì)照組 18.81±2.16 19.56±2.27 20.82±1.79 20.79±2.67 23.44±3.69模型組 18.91±1.84 28.55±5.44 48.94±4.96* 69.53±6.46* 88.00±5.39*地塞米松組 19.29±2.23 25.72±3.52 39.22±4.87*△ 58.81±8.14*△ 77.96±9.54*△低分子肝素組19.31±2.2827.01±3.4640.45±3.97*△49.16±5.86*△▲ 69.79±8.47*△

表3 各組肺組織羥脯氨酸含量的影響（，μg/mg，n=5）

表3 各組肺組織羥脯氨酸含量的影響（，μg/mg，n=5）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，▲P＜0.05。

組 別1d3d7d14d 28d正常對(duì)照組285.10±28.11291.11±27.78303.45±23.40303.66±30.59 319.20±35.59模型組289.45±25.50383.92±20.90*689.80±35.57*801.63±32.62* 888.87±32.72*地塞米松組286.00±24.65361.25±33.39*565.85±32.67*△698.02±48.92*△ 817.22±43.51*△低分子肝素組287.48±35.14363.01±30.67*572.66±25.20*△648.76±40.92*△ 758.36±44.44*△▲

肺纖維化的確切發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，細(xì)胞因子在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。此類細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β），血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF），腫瘤壞死因子（TNF-α，β，γ），白介素（IL-1、6、8），成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF），胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF），結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等[5-7]。TGF-β是致纖維化關(guān)鍵性的細(xì)胞因子，在其中起著重要的作用。TGF-β是研究最深入、作用最重要的細(xì)胞因子。TGF-β 3種異構(gòu)型（TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3）的生物學(xué)特征基本相同，其中TGF-β1與肺纖維化的關(guān)系最為密切，這在運(yùn)用TGF-β1抗體減弱博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化試驗(yàn)和特異性纖維性肺疾病的病人檢測(cè)到TGF-β1的合成增加的事實(shí)中得到證實(shí)[8]。TGF-β是一種生物學(xué)功能復(fù)雜的細(xì)胞因子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、黏附和運(yùn)動(dòng)及ECM的分泌，是組織生長(zhǎng)、修復(fù)、增殖的重要因子，也是肺纖維化發(fā)生過程中最直接的細(xì)胞因子。TGF-β1是一個(gè)強(qiáng)大的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)劑，通過血小板衍生生長(zhǎng)因子可促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞增殖。TGF-β1對(duì)于結(jié)構(gòu)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞有很重要的直接作用，是最重要的ECM蛋白刺激因子之一，被TGF-β1激活的成纖維細(xì)胞能促進(jìn)PGs在肺內(nèi)異常沉積[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，肺纖維化急性加重時(shí)，患者血漿D-二聚體明顯升高[10]。由于D-二聚體是血管內(nèi)凝血的標(biāo)志，因此認(rèn)為肺纖維患者凝血機(jī)制激活?？梢?肺組織微血管內(nèi)外微環(huán)境促凝和抗纖溶活性升高是肺纖維化發(fā)病的重要環(huán)節(jié)之一。有研究表明,肺纖維化的發(fā)病機(jī)制與肺內(nèi)微環(huán)境凝血機(jī)制異常有關(guān)。Kubo H等[10]對(duì)5家醫(yī)院的56例患者進(jìn)行了前瞻性抗凝治療研究，該試驗(yàn)顯示抗凝治療可以延長(zhǎng)肺纖維化患者中位生存天數(shù),改善患者預(yù)后。但對(duì)于抗凝治療改善預(yù)后的具體機(jī)制尚不清楚。

目前，對(duì)抗凝治療肺纖維化取得療效的確切機(jī)制尚不清楚，可能與其對(duì)血管內(nèi)外微環(huán)境的抗凝作用有關(guān)?？鼓委熆蓽p少細(xì)胞外纖維素沉積，提高ECM降解，促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞正常修復(fù)，凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制可減少與纖維化發(fā)生有關(guān)的產(chǎn)物及因子生成。并且，低分子肝素可下調(diào)參與肺纖維維化的TGF-β1，內(nèi)皮素1（ET-1），纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子1（FGF-1）的表達(dá)[11]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，LMWH對(duì)博來霉素誘發(fā)的大鼠肺間質(zhì)纖維化具有保護(hù)作用。其可能是通過下調(diào)TGF-β1的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的，其具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

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