郭永輝 周浩輝 徐維盛 龔寧波 呂 揚(yáng)

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

差示掃描量熱法對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值*

郭永輝 周浩輝 徐維盛 龔寧波 呂 揚(yáng)

（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050）

建立了采用差示掃描量熱法對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及不確定度評(píng)價(jià)的數(shù)學(xué)模型、有效檢測(cè)技術(shù)和分析方法。采用差示掃描量熱法測(cè)量芝麻酚樣品純度的實(shí)驗(yàn)條件為升溫速率3.0 K／min，稱樣量3.4～4.7 mg，爐內(nèi)氣體為靜態(tài)空氣。對(duì)通過均勻性檢驗(yàn)和長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值和不確定度評(píng)價(jià)，同時(shí)采用高效液相色譜法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證。芝麻酚在3.4～4.7 mg范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系（r2=0.999 2，n=6）；方法精密度為0.89%(n=6)；采用差示掃描量熱法及建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值及不確定度評(píng)價(jià)結(jié)果為99.46%±0.09%（k=2，P=0.95）。HPLC法測(cè)定純度平均值為99.53%。建立的差示掃描量熱法檢測(cè)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及不確定度評(píng)價(jià)，該檢測(cè)分析方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

芝麻酚 純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 差示掃描量熱法 定值及不確定度評(píng)價(jià) HPLC

芝麻酚是中藥材黑芝麻中的主要有效成分之一，又名3,4-亞甲二氧基苯酚，是芝麻油的重要香氣成分和品質(zhì)穩(wěn)定劑。芝麻酚具有非常強(qiáng)的抗氧化能力，常用于食品、醫(yī)藥的抗氧化劑，同時(shí)它更是合成抗高血壓藥物、心血管藥物的重要起始原料，也是農(nóng)藥胡椒基丁基醚的原料[1,2]。目前芝麻酚在國(guó)際上非常緊俏，尤其是藥物合成領(lǐng)域的需求量很大。研究芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)于我國(guó)藥物質(zhì)量控制具有重要的科學(xué)意義。

依據(jù)我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制的技術(shù)規(guī)范管理要求和定值的一般原則及統(tǒng)計(jì)方法[3,4]，筆者基于差示掃描量熱法（DSC）建立了芝麻酚高純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值檢測(cè)分析方法和不確定度評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型，為研制國(guó)家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供了有效檢測(cè)技術(shù)和分析方法。差示掃描量熱法測(cè)量物質(zhì)純度是依據(jù)物質(zhì)的熔點(diǎn)因雜質(zhì)成分存在而下降的基本原理。其樣品中的雜質(zhì)成分含量越多，其熔點(diǎn)值下降越大。只有當(dāng)物質(zhì)化學(xué)純度中的雜質(zhì)成分摩爾分?jǐn)?shù)小于2%時(shí)，物質(zhì)熔點(diǎn)的下降與雜質(zhì)含量的關(guān)系可用Van’t Hoff方程表示，即建立不確定度評(píng)價(jià)數(shù)學(xué)模型為：

式中：T0——理想中的純物質(zhì)熔點(diǎn)值（凝固點(diǎn)），K；

Tm——物質(zhì)的真實(shí)熔點(diǎn)值（凝固點(diǎn)），K；

R——?dú)怏w常數(shù)，即8.314 J／（K·mol）；

x——純物質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)；

ΔH——物質(zhì)的摩爾熔融焓變值，J／mol；

T0-Tm——物質(zhì)純度值因各種雜質(zhì)成分存在而導(dǎo)致的熔點(diǎn)下降量。

目前文獻(xiàn)報(bào)道芝麻酚純度測(cè)定的方法僅限于高效液相色譜法[5,6]，而差示掃描量熱法在純度測(cè)定中已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用[7-10]。利用建立的DSC檢測(cè)芝麻酚純度分析方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性考察，完成對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度定值和不確定度評(píng)價(jià)。利用高效液相色譜法對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度進(jìn)行了不同原理檢測(cè)方法的結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果表明筆者建立的差示掃描量熱法測(cè)定芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢測(cè)分析方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

差示掃描量熱儀：DSC-1型，標(biāo)準(zhǔn)40 μL 鋁坩堝，瑞士Mettler Toledo公司；

電子天平：XS105型，感量0.01 mg，瑞士Mettler Toledo公司；

高效液相色譜儀：1200型，配有DAD檢測(cè)器，Agilent Chemstation色譜工作站，美國(guó)Agilent 公司；

甲醇：HPLC級(jí)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific有限公司；

純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；

一級(jí)銦標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：GBW13202，熔 點(diǎn)(429.75±0.01) K；

芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

(1)差示掃描量熱法

精密稱取芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品適量，置于40 μL的標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝中，壓蓋，放置于差示掃描量熱儀中，采用空的40 μL標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝作為參比。實(shí)驗(yàn)條件：升溫速率3.0 K／min，稱樣量為3.4～4.7 mg，爐內(nèi)氣體為靜態(tài)空氣。記錄DSC熱流值變化曲線，采用Mettler Toledo公司的STARe分析軟件計(jì)算其純度。圖1為芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DSC檢測(cè)圖譜。

圖1 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DSC檢測(cè)圖譜

(2)高效液相色譜法

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的高效液相色譜條件[5,6]經(jīng)優(yōu)化后進(jìn)行芝麻酚純度測(cè)定。采用Agilent Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水（40∶60）；檢測(cè)波長(zhǎng)：295 nm；流速：1.0 mL／min；柱溫：45℃；進(jìn)樣量：10 μL。記錄色譜圖及峰面積，利用峰面積歸一化法進(jìn)行純度測(cè)定。

2 DSC方法學(xué)驗(yàn)證

2.1 線性方程與線性范圍

分別精密稱取6份3.4～4.7 mg之間不同質(zhì)量的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.2(1)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄熱流值變化曲線及峰面積。以樣品的質(zhì)量X（mg）為橫坐標(biāo)，吸熱峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，芝麻酚的質(zhì)量在3.4～4.7 mg內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=115.074 7X+51.518 2，r2=0.999 2（n=6）。

2.2 方法的精密度

分別精密稱取6份4.25 mg左右的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.2(1)條件每份測(cè)定1次。6份芝麻酚峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.89%，表明方法的精密度良好。

3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、穩(wěn)定性驗(yàn)證與定值

3.1 均勻性檢驗(yàn)

從500個(gè)已經(jīng)分裝成最小包裝單元（瓶）中，隨機(jī)抽取j（15）瓶樣品，按1.2(1)條件采用DSC法進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)。在重復(fù)性條件下對(duì)每瓶進(jìn)行i（3）次獨(dú)立檢測(cè)，共獲得Xij（45）個(gè)數(shù)據(jù)；采用單因素方差分析對(duì)均勻性檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算每瓶在重復(fù)性條件下獲得的3個(gè)數(shù)據(jù)的平方和，獲得組內(nèi)平方和數(shù)據(jù)。計(jì)算每一瓶i（3）個(gè)數(shù)據(jù)的平均值，共獲得j（15）個(gè)平均值，以j個(gè)平均值作為一組數(shù)據(jù)，計(jì)算j（15）個(gè)數(shù)據(jù)的平方和，獲得組間平方和數(shù)據(jù)。計(jì)算組內(nèi)和組間各自相應(yīng)的均方差（MS），并用組間均方差除以組內(nèi)均方差計(jì)算得統(tǒng)計(jì)量F值。計(jì)算各自的自由度N1（組間）和N2（組內(nèi)），確定顯著性水平α。查F分布表中相應(yīng)N1、N2、α所對(duì)應(yīng)的F臨界值，并與計(jì)算獲得的統(tǒng)計(jì)量F進(jìn)行比較，若統(tǒng)計(jì)量F小于臨界值F，則瓶與瓶之間樣品非均勻引入的離散性與測(cè)量方法引入的離散性相比，可以忽略不計(jì)，認(rèn)為樣品均勻；反之樣品不均勻。

芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果見表1，方差分析結(jié)果見表2。經(jīng)上述方法分析，得到F值為1.75，查F檢驗(yàn)臨界值表知：F0.05(14,30)= 2.04，即，F(xiàn)＜F0.05(14,30)。結(jié)果表明，芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度具有良好的均勻性。

表1 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

表2 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)方差分析結(jié)果

3.2 穩(wěn)定性考察

對(duì)均勻性檢驗(yàn)合格的樣品采用DSC法，在12月內(nèi)按“先密后疏”的原則對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性考察，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取樣6瓶，每瓶取樣1次，按1.2(1)條件進(jìn)行檢驗(yàn)，以樣品純度為指標(biāo)考察樣品穩(wěn)定性。按照《國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指南35》[2]規(guī)定，以X代表時(shí)間，以Y代表標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值（芝麻酚的純度），擬合成一條直線，獲得直線方程為Y= -0.000 002X+0.994 524，則斜率為：

自由度為n-2=6-2=4，P=0.95（95%置信區(qū)間）的t因子等于2.7 7 6。由于故斜率是不顯著的，因而未觀察到不穩(wěn)定性。因此包裝后的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在12月內(nèi)穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)見表3。

表3 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察檢測(cè)結(jié)果

3.3 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)DSC法定值

(1)定值測(cè)定

隨機(jī)抽取通過均勻性檢驗(yàn)及穩(wěn)定性考察的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品10瓶，按1.2(1)條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算其純度。檢測(cè)結(jié)果見表4。

表4 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的DSC純度檢測(cè)結(jié)果

(2)可疑值剔除—格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)

采用格拉布斯檢驗(yàn)對(duì)得到的10組芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度值進(jìn)行可疑值剔除，得到的純度值經(jīng)計(jì)算得G=1.967。查格拉布斯臨界值表可知：G0.95(10)=2.176。因G＜G0.95(10)，故10組數(shù)據(jù)中無可疑值存在。

(3)標(biāo)準(zhǔn)值確定

通過格拉布斯（Grubbs）檢驗(yàn)的10組純度值的平均值即為標(biāo)準(zhǔn)值。由表4的定值數(shù)據(jù)確定芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的標(biāo)準(zhǔn)值為99.46%。

(4)不確定度評(píng)定

標(biāo)準(zhǔn)值的不確定度由3部分組成：（1）通過測(cè)量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差、測(cè)量次數(shù)及所要求的置信水平按統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算；（2）通過對(duì)測(cè)量影響因素的分析，估計(jì)出其大??；（3）物質(zhì)不均勻性和物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動(dòng)性所引起的不確定度。由于該芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已通過均勻性檢驗(yàn)及長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察，因此由物質(zhì)不均勻性和物質(zhì)在有效期內(nèi)的變動(dòng)性所引起的不確定度可忽略不計(jì)。根據(jù)JJF 1059-1999[11]及建立的數(shù)學(xué)模型，不確定度評(píng)定結(jié)果見表5。

表5 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評(píng)定結(jié)果

合成不確定度u為：

擴(kuò)展不確定度U=ku，k取2，計(jì)算擴(kuò)展不確定度為U=0.000 400 3×2=0.000 800 6，P=0.95。則芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度定值結(jié)果及不確定度表示為：99.46%±0.09%（k=2，P=0.95）。

4 高效液相色譜法方法學(xué)驗(yàn)證

4.1 線性方程與線性范圍

精密稱取芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品24.98 mg，置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，配制成濃度為999.2 μg／mL儲(chǔ)備液。分別精密吸取0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、8.0 mL至10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，獲得10.0、50.0、99.9、249.8、499.6、799.4 μg／mL 6種濃度溶液。按1.2(2)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以芝麻酚濃度X（μg／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液濃度在10.0～799.4 μg／mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=15.871X+56.088，r2=0.999 8(n=6)。

4.2 儀器精密度

精密稱取1份12.5 mg的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于25 mL容量瓶中，使用流動(dòng)相定容，按1.2(2)條件進(jìn)行測(cè)定。重復(fù)測(cè)定6次芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.16%，表明儀器精密度良好。

4.3 方法精密度

精密稱取6份芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度，按1.2(2)項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定的6份芝麻酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%，表明方法精密度良好。

4.4 高效液相色譜法純度驗(yàn)證

按1.2(2)色譜條件對(duì)3份芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了化學(xué)純度測(cè)定。精密稱取約12.5 mg芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，置于25 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并定容至刻度。每份樣品測(cè)定3次，利用峰面積歸一化法計(jì)算純度值。芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)高效液相色譜法的定值檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的HPLC純度檢測(cè)結(jié)果

5 結(jié)論

采用差示掃描量熱法對(duì)芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值，對(duì)定值結(jié)果的不確定度進(jìn)行了評(píng)定，并用高效液相色譜法進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，兩種方法測(cè)定結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，研制的芝麻酚純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為高純度化學(xué)物質(zhì)。該物質(zhì)已于2011年5月成功申報(bào)為國(guó)家一級(jí)化學(xué)成分純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW09538）。

差示掃描量熱法具有樣品用量少、樣品前處理簡(jiǎn)單、操作快速、不使用溶劑，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。采用差示掃描量熱法測(cè)定芝麻酚化學(xué)純度的檢測(cè)方法具有科學(xué)性和應(yīng)用性，為高純度化學(xué)物質(zhì)的純度檢測(cè)提供了一種新的檢測(cè)技術(shù)和分析方法。

鑒于目前用于化學(xué)純度的檢測(cè)分析方法較為有限，由多種不同原理檢測(cè)技術(shù)對(duì)結(jié)果驗(yàn)證是分析測(cè)量的一種趨勢(shì)，新技術(shù)、新方法的研究和應(yīng)用將有助于推動(dòng)科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步和發(fā)展。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：323.

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[3] JJF 1006-1994 一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范[S].

[4] CNAS-GL29 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法[S].

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[11] JJF 1059-1999 測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].

DEFINING VALUE OF SESAMOL PURITY REFERENCE MATERIALS BY DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY

Guo Yonghui， Zhou Haohui， Xu Weisheng， Gong Ningbo， Lü Yang
(Peking Union Medical College, Institute of Materia Medica & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 10050, China)

The analytical method and mathematical model for purity and uncertainty evaluation of sesamol purity reference materials were established. The purity of the substance was measured by the DSC. The experimental conditions were listed below：the heating rate at 3.0 K／min, the sample weight was 3.4-4.7 mg, furnace gas as a static air. The purity and uncertainty value of sesamol was determined, which through the uniformity test and long-term stability inspection. The purity value results were verified by HPLC method. The calibration curves showed good linearity (r2=0.9992,n=6) within tested mass ranges of sesamol (3.4-4.7 mg). The RSD was 0.89%(n=6). The purity value of sesamol purity reference materials determined by DSC was 99.46%±0.09%(k=2，P=0.95), and 99.53% by HPLC. The differential scanning calorimetry method developed in this study was validated to be simple, rapid, accurate, reliable, and was successfully applied to the purity and uncertainty evaluation of sesamol purity reference materials.

sesamol, purity reference materials， DSC， purity value and uncertainty evaluation， HPLC

*科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(2007FY130100)；重大新藥創(chuàng)制“十一五”規(guī)劃項(xiàng)目(2009ZX09501-021)；衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng)(200902008-02)

2011-08-17