林廣慶，嚴(yán)鵬科，羅其富，謝金魁（1.廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院藥劑科，廣州市 510150；.南華大學(xué)藥理研究所，衡陽市 41000）

蛞蝓（Limax）為有肺的軟體動(dòng)物，屬腹足類腹足綱蛞蝓科，我國各地有產(chǎn)。因其體表布滿黏液，形似蝸牛而無殼，故又俗稱“黏蟲”、“鼻涕蟲”。作為傳統(tǒng)中藥，蛞蝓“味咸寒，入肺、肝、大腸經(jīng)。無毒”。功能“清熱祛風(fēng)，消腫解毒，破瘀通經(jīng)”。主治中風(fēng)、筋脈拘攣、驚癇、喘息、喉痹、咽腫、癰腫、丹毒、經(jīng)閉、癥瘕、蜈蚣咬傷等證。

蛞蝓凍干粉是以廣西百色地區(qū)出產(chǎn)的足襞蛞蝓新鮮全蟲，經(jīng)勻漿、凍干后制備的膠囊劑，屬中藥2類新藥。本文旨在按《中藥新藥研究指南》和《藥物研究技術(shù)指導(dǎo)原則》開展蛞蝓凍干粉治療慢性支氣管炎的臨床前藥效學(xué)研究，探討蛞蝓凍干粉在鎮(zhèn)咳、化痰和平喘方面的作用，為臨床應(yīng)用其治療慢性支氣管炎等肺系疾病提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CH型顯微鏡攝影系統(tǒng)（日本Olympus公司）；FA1004型電子天平（上海天平儀器廠）；1512型切片機(jī)（德國Leica公司）；402A1型超聲霧化器（江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；UV-160A型分光光度計(jì)（日本島津公司）。

1.2 試藥

蛞蝓凍干粉（南華大學(xué)藥物藥理研究所，批號(hào):20050012）；地塞米松（批號(hào):091107）、右美沙芬（批號(hào):091027）均由武漢遠(yuǎn)成藥業(yè)有限公司提供；氯化乙酰膽堿（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):040910）；氯化銨（北京制藥廠，批號(hào):021018）；苯酚紅（批號(hào):980820）、碳酸氫鈉（批號(hào):031012）均購自北京化工廠；磷酸組胺、脂多糖（LPS）、氨茶堿、二氧化硫（SO2）均購自北京利科藥物公司。

1.3 動(dòng)物

昆明種小鼠，♀♂兼半，體重18～22 g；SD大白鼠，♀♂兼半，體重150～200 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào):SCXK（湘）2003-0003）。動(dòng)物置于符合中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量國家清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng)，室溫20～25℃，相對(duì)濕度55%～70%。鼠用全價(jià)顆粒飼料由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 給藥劑量的設(shè)定

原料樣品為淡黃色粉末，氣微腥，味微苦腥。實(shí)驗(yàn)時(shí)藥物用0.9%生理鹽水溶液配制，置冰箱中貯藏，臨用時(shí)搖勻。

預(yù)期人臨床日用量為700mg，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的高劑量按體重折算為成人臨床日用量的3倍，高、中、低劑量以3為等比遞減。小鼠高、中、低劑量分別為300、100、33mg·kg-1，給藥濃度分別為30、10、3.3 g·L-1，給藥體積為10mL·kg-1。大鼠高、中、低劑量分別為210、70、23mg·kg-1，給藥濃度分別為21、7、2.3 g·L-1，給藥體積為10mL·kg-1。

2.2 慢性支氣管炎模型的SO2刺激實(shí)驗(yàn)[1，2]

取18～22 g小白鼠90只，♀♂兼用。按隨機(jī)分組法分為6組，即正常對(duì)照、模型對(duì)照、地塞米松和蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組。正常對(duì)照組不給予SO2刺激，正常飼養(yǎng)；其余5組每天進(jìn)行SO2刺激，以復(fù)制慢性支氣管炎小鼠模型。

取一個(gè)8 L的玻璃鐘罩，在其中放一個(gè)蒸發(fā)皿，蒸發(fā)皿中加入0.5 g無水亞硫酸鈉，將小鼠放入鐘罩內(nèi)，向蒸發(fā)皿中迅速加入50%硫酸5mL后立即加蓋，刺激2min后取出，每天1次，持續(xù)21 d。

SO2刺激21 d后，正常對(duì)照和模型對(duì)照組ig生理鹽水15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松組ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并從第8天開始同時(shí)ig右美沙芬15mg·kg-1，每天1次，共3 d；蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組分別ig蛞蝓凍干粉300、100、33mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期間觀察各組小鼠的整體情況，并在末次給藥1 h后，給予SO2刺激，觀察并記錄每只小鼠的咳嗽潛伏期和在3min內(nèi)咳嗽次數(shù)。用藥組小鼠咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)與模型對(duì)照組進(jìn)行比較，并作組間t檢驗(yàn)。

2.3 慢性支氣管炎模型的氣管段酚紅實(shí)驗(yàn)[1]

分組與復(fù)制模型同“2.2”項(xiàng)下方法。

SO2刺激21 d后，正常對(duì)照和模型對(duì)照組ig生理鹽水15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松組ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并從第8天開始同時(shí)ig1.2%的氯化銨溶液，每只0.5mL，每天1次，共3 d；蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組分別ig蛞蝓凍干粉300、100、33mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期間觀察各組小鼠的整體情況，并在末次給藥0.5 h后，ip1%生理鹽水苯酚紅溶液，每只0.5mL，再過0.5 h脫臼處死小鼠，將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)，剪開頸部正中皮膚，小心剔除氣管周圍組織，剪下環(huán)狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入5%碳酸氫鈉溶液中，并進(jìn)行氣管內(nèi)灌洗，來回3次，靜置，第2天進(jìn)行吸光度（OD）值的測(cè)定（用分光光度計(jì)在546 nm波長處測(cè)定OD值，用酚紅作一標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)曲線計(jì)算出酚紅含量）。

2.4 慢性支氣管炎模型的噴霧致喘實(shí)驗(yàn)[1，3]

取150～200 g健康SD大鼠，♀♂兼用。實(shí)驗(yàn)前預(yù)選大鼠，預(yù)選方法:取引喘液（4%磷酸組胺加2%氯化乙酰膽堿）10mL注入超聲霧化儀，開啟霧化儀，噴霧1min，測(cè)定引喘潛伏期（噴霧開始至抽搐跌倒的時(shí)間），超過10min無反應(yīng)者棄去。選出75只動(dòng)物，按隨機(jī)分組的方法分為5組，即模型對(duì)照、地塞米松和蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組，每組15只，復(fù)制慢性支氣管炎模型。

用10%水合氯醛溶液，以3mL·kg-1的劑量ip麻醉大鼠。將麻醉后的大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，拉出舌體，暴露聲門，用長約8cm、直徑0.1cm的聚乙烯管作氣管導(dǎo)管，快速將氣管導(dǎo)管插入氣管，蘸取少量清水涂于管口，水柱隨大鼠呼吸上下移動(dòng)，說明確實(shí)已插入氣管，將200μg（200μL）LPS注入氣管內(nèi)，飼養(yǎng)21 d。

復(fù)制模型21 d后，模型對(duì)照組ig生理鹽水溶液15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松組ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d，并從第8天開始同時(shí)ig氨茶堿100mg·kg-1；蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組分別ig蛞蝓凍干粉210、70、23mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期間觀察各組大鼠的整體情況，并在末次給藥1 h后，按預(yù)選實(shí)驗(yàn)同等條件和方法再次測(cè)定引喘潛伏期，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果并作組間t檢驗(yàn)。

2.5 慢性支氣管炎模型的病理組織觀察

預(yù)選大鼠、分組與復(fù)制模型方法同“2.4”項(xiàng)下方法。

復(fù)制模型21 d后，模型對(duì)照組ig生理鹽水溶液15mL·kg-1，每天1次，共10 d；地塞米松組ig地塞米松1.2mg·kg-1，每天1次，共10 d；蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組分別ig蛞蝓凍干粉210、70、23mg·kg-1，每天1次，共10 d。

期間觀察各組大鼠的整體情況，10 d后將大鼠ip10%水合氯醛溶液4mL·kg-1麻醉，將麻醉后的大鼠固定于手術(shù)臺(tái)，打開頸部、胸腔，取氣管及肺組織，觀察大體標(biāo)本的情況，然后用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片并行HE染色，顯微鏡觀察肺組織支氣管的炎性病變程度，包括上皮的完整性、腺體的厚度、黏膜下炎性細(xì)胞浸潤情況、淋巴濾泡，以及氣管壁的厚度和腺體層厚度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用Student t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)處理軟件為SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。

3 結(jié)果

3.1 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的止咳作用

蛞蝓凍干粉高、中劑量組咳嗽次數(shù)與模型對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05），咳嗽潛伏期也顯著縮短（P＜0.05）。蛞蝓凍干粉低劑量組咳嗽潛伏期有增加的趨勢(shì)，但無顯著性差異。蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的止咳作用見表1。

3.2 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的祛痰作用

蛞蝓凍干粉高、中劑量組的氣管段酚紅含量顯著高于模型對(duì)照組（P＜0.05），高劑量組的酚紅含量與陽性對(duì)照藥地塞米松+氯化銨（1.2%）療效相當(dāng)。蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的祛痰作用見表2。

表1 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的止咳作用（n＝15）Tab 1 Cough-relieving effect of Limax lyophilized powder on mice models of chronic bronchitis（n＝15）

表2 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型小鼠的祛痰作用（n＝15）Tab 2 Effect of Limax lyophilized powder on expectorant in mice models of chronic bronchitis（n＝15）

3.3 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠的平喘作用

蛞蝓凍干粉高、中劑量組與模型組比較，引喘潛伏期均顯著延長（P＜0.05）。蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠的平喘作用見表3。

表3 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠的平喘作用（n＝15）Tab 3 Effect of Limax lyophilized powder on asthma in mice models of chronic bronchitis（n＝15）

3.4 蛞蝓凍干粉對(duì)慢性支氣管炎模型大鼠病理改變的影響

大鼠在氣道內(nèi)滴入LPS后21 d間，出現(xiàn)倦怠，活動(dòng)減少，進(jìn)食及飲水減少，可聽見明顯的氣道痰鳴音。各用藥組ig10 d后，痰鳴音逐漸減輕；模型對(duì)照組大鼠氣道痰鳴音改變不明顯。大體標(biāo)本所見:肺組織膨脹腫大，呈灰白色，表面無出血及液體滲出。

顯微鏡所見:模型組大鼠氣道內(nèi)分泌物明顯增多，上皮不完整，氣道腺體增厚，氣管黏膜層、黏膜下層大量單核炎性細(xì)胞浸潤，支氣管外周淋巴濾泡形成；地塞米松組和蛞蝓凍干粉高、中、低劑量組大鼠氣道內(nèi)分泌物減少，氣管上皮層基本完整，氣管壁和腺體層較模型組變薄，黏膜下炎性細(xì)胞浸潤減輕，支氣管外周淋巴濾泡小。地塞米松組和蛞蝓凍干粉高劑量組與模型對(duì)照組比較有明顯差異。肺臟組織病理學(xué)檢查見圖1。

圖1 肺臟組織病理學(xué)檢查（HE染色，×40）A.模型對(duì)照組；B.氨茶堿組；C.蛞蝓凍干粉低劑量組；D.蛞蝓凍干粉中劑量組；E.蛞蝓凍干粉高劑量組Fig 1 Pathological observation of lung tissue in each group（HE staining，×40）A.model control group；B.aminophylline group；C.Limax lyophilized powder low-dose group；D.Limax lyophilized powder medium-dose group；E.Limax lyophilized powder high-dose group

4 討論

慢性支氣管炎是指氣管、支氣管黏膜及其周圍組織的慢性非特異性炎癥。臨床上以咳嗽、咳痰或伴有喘息及反復(fù)發(fā)作的慢性過程為特征，屬中醫(yī)咳嗽、喘癥、肺脹等范疇。該病若緩慢進(jìn)展，常并發(fā)阻塞性肺氣腫，甚至肺動(dòng)脈高壓、肺原性心臟病[4]。

蛞蝓，作為一種藥用動(dòng)物源遠(yuǎn)流長，早在古代的中醫(yī)藥著作中就對(duì)蛞蝓清熱解毒、活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)等功能，常用于治療咳、喘、痰鳴、咽喉腫痛等癥候都有詳細(xì)的記載[5]。其近年的臨床應(yīng)用主要集中在治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺系疾病和抗癌作用兩大方面。而國外研究者僅利用蛞蝓作為嗅覺和味覺神經(jīng)調(diào)控的動(dòng)物模型來研究[6]。蛞蝓凍干粉是以廣西百色地區(qū)出產(chǎn)的足襞蛞蝓新鮮全蟲，經(jīng)勻漿、凍干后制備的膠囊劑，按《藥品注冊(cè)管理辦法》規(guī)定，為新發(fā)現(xiàn)的藥材及其制劑，屬中藥2類新藥。根據(jù)其以蛞蝓為藥材，以平喘為主要功效的特點(diǎn)，從而命名為蛞蝓凍干粉。

本研究采用SO2吸入法和LPS注入法復(fù)制小鼠和大鼠的慢性支氣管炎模型，并分別采用SO2刺激法進(jìn)行止咳實(shí)驗(yàn)、氣管段酚紅法進(jìn)行化痰實(shí)驗(yàn)、噴霧致喘法進(jìn)行平喘試驗(yàn)，并行病理組織觀察，以考察蛞蝓凍干粉治療慢性支氣管炎的止咳、化痰和平喘的功效，以及對(duì)炎癥病理改變的治療作用。研究結(jié)果表明，蛞蝓凍干粉能明顯延長咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具止咳作用；能使小鼠氣管段酚紅排泄量明顯增加，提示化痰作用增強(qiáng)；能延長組胺-乙酰膽堿誘發(fā)的哮喘潛伏期，提示具平喘作用；并能改善慢性支氣管炎模型大鼠的炎癥病理改變?？梢姡因鮾龈煞蹖?duì)慢性支氣管炎具較好的治療作用。

[1]陳 奇主編.中藥藥理研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:224.

[2]施新猷主編.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京:人民軍事出版社，2000:447.

[3]馬 楠，崔德健，梁延杰，等.氣道內(nèi)注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管模型[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，1999，22（6）:371.

[4]周 躍，孫仁華.烏拉地爾治療肺動(dòng)脈高壓、肺心病、心力衰竭的療效及對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響[J].中國藥房，1998，9（3）:125.

[5]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典（下冊(cè)）[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社，1977:2375.

[6]Watanabe S，Inoue T，Murakami M，et al.Modulation of oscillatory neural activities by cholinergic activation of interneurons in the olfactory center of a terrestrial slug[J].Brain Research，2001，896（1-2）:30.