肖 維，彭 健，張陽德

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，為臨床常見的惡性腫瘤，而且其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［1］。大腸癌血液微轉(zhuǎn)移腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與大腸癌的預(yù)后密切相關(guān)［2］，但是目前仍然缺乏高度特異性和靈敏性的早期診斷的實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)［3］。本研究通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增 (RT－PCR)法檢測(cè)大腸癌患者外周血液中癌胚抗原 (CEA)mRNA和livin mRNA的表達(dá)情況，探討二者對(duì)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌血液微轉(zhuǎn)移腫瘤的意義，指導(dǎo)臨床對(duì)大腸癌的診療，對(duì)其預(yù)后做出客觀的判斷。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2009年2月—2010年3月就診于中南大學(xué)湘雅醫(yī)院肝膽腸外科的初發(fā)、初治大腸癌患者60例為研究對(duì)象，均經(jīng)腸鏡或手術(shù)病理檢查證實(shí);同時(shí)選取同時(shí)期30例大腸良性疾病 (息肉、腺瘤、腸炎、憩室等)患者為大腸良性疾病組和30例健康體檢正常者為對(duì)照組。大腸癌組男32例，女28例;年齡30～76歲，平均年齡 (56±3)歲;結(jié)腸癌25例，直腸癌35例;低中分化36例，高分化24例;Dukes A+B期31例，Dukes C+D期29例;有局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例;有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移13例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移47例。大腸良性疾病組男17例，女13例;年齡22～73歲，平均年齡 (51±6)歲;息肉14例，腺瘤9例，腸炎5例，憩室2例。對(duì)照組男18例，女12例，年齡27～69歲，平均年齡 (49±7)歲。3組在性別及年齡方面具有均衡性。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑 (GIBCO公司)，PCR引物、RT－PCR試劑盒由大連寶生生物公司合成和生產(chǎn)，電泳儀為北京六一公司產(chǎn)品，紫外分光光度儀、PCR儀為美國Thermo產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio－RAD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 CEA、livin和內(nèi)參GAPDH引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)genebank提供的基因信息，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0自行設(shè)計(jì)引物，交由大連寶生生物公司合成，序列如表1所示。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增長度Table 1 PCR primer sequences and amplification length

1.3.2 總RNA提取 患者入院第2天抽取肘靜脈血5 ml，采血管肝素鈉抗凝，去酶處理。采血后1 h內(nèi)利用淋巴細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，參照說明書使用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定其純度和濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)鑒定RNA的完整性。

1.3.3 RT－PCR法檢測(cè)CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)應(yīng)用大連寶生生物公司生產(chǎn)的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0兩步法試劑盒進(jìn)行RT及PCR，分別為10μl和40μl體系，按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行，RT反應(yīng)條件:30℃×10 min，42℃ ×30 min，99℃ ×5 min，5℃ ×5 min，1個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃ ×2 min，1個(gè)循環(huán)，再94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s。共40個(gè)循環(huán)，延伸72℃ 5 min。最后所得產(chǎn)物在含0.45μg/ml溴化乙啶的1%瓊脂糖凝膠中電泳分離 (100 V，45 min)，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察和分析結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RNA完整性及純度鑒定結(jié)果 1%瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)顯示所有RNA皆有5 S、18 S和28 S3條帶，28 S條帶亮度最高 (見圖1)，證實(shí)RNA完整性良好。紫外分光光度計(jì)測(cè)得所有樣本RNA的A 260/A 280處于1.8～2.0，證明RNA純度較高，排除蛋白質(zhì)及DNA污染。

2.2 大腸癌組、大腸良性疾病組和對(duì)照組CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)情況 60例大腸癌患者中CEA mRNA陽性表達(dá)率為58.3%(35/60)，livin mRNA陽性表達(dá)率為61.6%(37/60)。大腸良性疾病組和對(duì)照組中CEA mRNA和livin mRNA均無陽性表達(dá)。3組CEA mRNA和livin mRNA陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05)。CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR擴(kuò)增見圖2。

圖1 大腸癌組、大腸良性疾病組和對(duì)照組RNA電泳圖Figure 1 RNA electrophoresis figure of colorectal cancer group，benign disease group and control group

圖2 CEA mRNA和livin mRNA的RT－PCR擴(kuò)增圖Figure 2 RT－PCR figure of CEA mRNA and livin mRNA

2.3 大腸癌組患者CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 大腸癌患者外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)與性別、年齡、腫瘤分化程度及腫瘤部位無明顯相關(guān)性(P＞0.05);而與腫瘤的臨床分期、有無淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān) (p＜0.05，見表2)。即腫瘤臨床分期越晚，出現(xiàn)淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，CEA mRNA和livin mRNA的陽性表達(dá)率越高。

2.4 CEA mRNA和livin mRNA聯(lián)合檢測(cè)與單一檢測(cè)陽性率比較 大腸癌患者CEA mRNA和livin mRNA雙陽性20例，CEA mRNA陽性而livin mRNA陰性15例，CEA mRNA陰性而livin mRNA陽性17例。CEA mRNA和livin mRNA聯(lián)合檢測(cè)陽性率為86.7%(52/60)，與CEA mRNA單項(xiàng)陽性率58.3%(35/60)及l(fā)ivin mRNA單項(xiàng)陽性率61.6%(37/60)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2值分別為12.079和9.786，p＜0.05)。

表2 大腸癌組患者CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Table 2 Relationship between CEA and livin mRNA expression and clinical features in colonrectal cancer patient

3 討論

大腸癌為臨床常見腫瘤，目前主要治療手段包括手術(shù)治療、化療、放射治療等。研究表明，大腸癌5年生存率約為50%，即使臨床病變較早期的病理檢測(cè)淋巴結(jié)陰性的患者，5年內(nèi)仍有20% ～30% 死于轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)［4］。大腸癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移很大程度上與腫瘤微轉(zhuǎn)移有關(guān)［5］。分析其原因有:(1)大腸癌早期發(fā)病沒有癥狀或者癥狀輕微，容易導(dǎo)致患者的忽視，常規(guī)檢查不能較早的檢測(cè)出處于早期或者隱匿期的大腸癌。然而早期腫瘤已經(jīng)存在微轉(zhuǎn)移腫瘤［6］。(2)已經(jīng)確診為大腸癌的患者，即使接受了正規(guī)的手術(shù)或者放化療治療，可能在治療之前就已經(jīng)存在了微腫瘤的局部或者遠(yuǎn)處的血道轉(zhuǎn)移，而這些微轉(zhuǎn)移灶是常規(guī)病理細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)檢查還不能發(fā)現(xiàn)的［3］。

CEA是一種特異性較高的腫瘤相關(guān)抗原，大約95%大腸癌有CEA基因的表達(dá)，CEA在小細(xì)胞肺癌、乳腺癌等中也有表達(dá)。目前，CEA mRNA被廣泛用于大腸癌微轉(zhuǎn)移檢測(cè)。Wang等［7］研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者外周血CEA mRNA的陽性表達(dá)率為72.2%，特異性為100.0%，其陽性表達(dá)率可獨(dú)立預(yù)測(cè)術(shù)后轉(zhuǎn)移，與腫瘤侵潤深度、血管侵犯和TNM分期顯著相關(guān)。Sadahiro等［8］通過長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，大腸癌根治術(shù)后7～10 d外周血CEA mRNA仍然陽性患者其術(shù)后復(fù)發(fā)率明顯增高，無病生存 (DFS)和總生存 (OS)明顯差于CEA mRNA陰性患者。朱元祺等［9］研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者外周血中CEA mRNA陽性表達(dá)率為45.0%，在健康人體內(nèi)無表達(dá)，CEA mRNA陽性表達(dá)率與腫瘤分期相關(guān)。

細(xì)胞的凋亡受抗凋亡蛋白如Bcl－2家族和凋亡抑制蛋白(IAP)家族的調(diào)控［10］。livin是IAP家族中新近發(fā)現(xiàn)的一種凋亡蛋白，可以通過抗死亡受體途徑、抗線粒體途徑和激活JNKl信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡和抵抗腫瘤放化療作用［11］。livin在成人的正常組織中幾乎不表達(dá)，而在腫瘤組織表達(dá)明顯上調(diào)［12］。許多 livin基因表達(dá)與腫瘤的研究顯示，livin基因顯著表達(dá)于膀胱癌、小細(xì)胞肺癌、肝癌、大腸癌等惡性腫瘤，且其表達(dá)水平的高低與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移及預(yù)后情況相關(guān)［13－14］。

本研究利用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，CEA mRNA和livin mRNA在大腸良性疾病患者和健康者外周血中均無表達(dá)，而在大腸癌患者中陽性表達(dá)率分別為58.3%(35/60)和61.6%(37/60)。CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)均與患者性別、年齡、腫瘤分化程度及腫瘤部位無明顯相關(guān)性，而隨著腫瘤的Dukes臨床分期越晚，出現(xiàn)局部和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，CEA mRNA和livin mRNA表達(dá)增高。由此推測(cè)，CEA和livin可能與腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)有關(guān)，外周血中CEA mRNA和livin mRNA的檢測(cè)有助于發(fā)現(xiàn)早期血道微轉(zhuǎn)移，其在外周血中的表達(dá)可能是大腸癌惡化發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移所伴隨的分子生物學(xué)變化。因此，通過檢測(cè)大腸癌CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)有助于大腸癌的早期診斷及微轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)。

Xu等［15］采用實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)檢測(cè)大腸癌患者外周血CK20 mRNA、CK19 mRNA、CEA mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)即使在早期腫瘤患者的外周血中都有較高的陽性率，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)2個(gè)或3個(gè)指標(biāo)時(shí)，可以極大地提高陽性檢出率，對(duì)于檢測(cè)早期大腸癌血液循環(huán)中的腫瘤細(xì)胞有意義。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)檢測(cè)CEA mRNA或livin mRNA，陽性檢測(cè)率分別為58.3%和61.6%。而聯(lián)合檢測(cè)陽性檢出率提高到86.7%。因此，聯(lián)合檢測(cè)CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)對(duì)于大腸癌早期診斷和血液中微轉(zhuǎn)移腫瘤的發(fā)現(xiàn)具有重要意義，進(jìn)而可以預(yù)測(cè)大腸癌患者預(yù)后。同時(shí)，由于CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)與腫瘤的分期有關(guān)，表達(dá)陽性可以提示血液微腫瘤的存在，可以動(dòng)態(tài)觀察大腸癌患者血液中CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)，有助于指導(dǎo)臨床治療。

總之，利用RT－PCR技術(shù)檢測(cè)外周血中CEA mRNA和livin mRNA的表達(dá)能夠早期診斷大腸癌和早期發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移腫瘤，進(jìn)而指導(dǎo)臨床治療，判斷預(yù)后。

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