程 瑗 金曉芝 葉 超 陳永平 章圣輝 洪煒龍 谷甸娜 張 磊 鄭明華

乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，我國是慢性乙型病毒性肝炎(CHB)的高發(fā)區(qū)，慢性HBV感染導(dǎo)致肝臟持續(xù)損傷、肝纖維化，并可進(jìn)一步發(fā)展成為肝硬化以及肝癌。CHB的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中宿主免疫調(diào)節(jié)的紊亂是導(dǎo)致機(jī)體不能有效清除病毒的重要原因之一[1]。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是一類具有調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞群體，能夠分泌細(xì)胞因子TGF-β1等，通過調(diào)節(jié)外周免疫耐受來控制效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)。有學(xué)者認(rèn)為Treg在慢性HBV感染時宿主免疫反應(yīng)缺陷的過程中起了重要作用[2]，目前國內(nèi)外關(guān)于Treg與HBV感染的研究中大多數(shù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Treg在慢性活動性乙型肝炎(chronic active hepatitis)及ASCs患者外周血中的數(shù)量較正常人升高，研究中大都選擇了未經(jīng)抗病毒治療的急慢性乙型病毒性肝炎患者來觀察，關(guān)于接受抗病毒治療后的CHB患者外周血中Treg的數(shù)量和功能研究不多，且關(guān)于Treg跟HBV感染者各臨床參數(shù)之間的相關(guān)性的結(jié)果仍存在較大爭議[2～6]。此次，我們收集了45例應(yīng)用核苷類似物抗病毒藥治療后HBV-DNA低于檢測值水平的CHB患者外周血，并按B超檢查結(jié)果將患者分為3組，其中單純CHB、CHB慢性肝病、CHB肝硬化患者各15例，與15例ASCs者以及15例正常成年人對照，觀察CD4+CD25+Treg細(xì)胞在這部分患者外周血中的數(shù)量變化情況，并分析Treg與患者年齡，HBeAg定量、ALT、AST以及血漿TGF-β1水平的相關(guān)性。

材料與方法

1.研究對象:CHB患者45例，ASCs者15例，所有病例均為2009年10月～2010年7月筆者醫(yī)院門診患者，符合2000年西安會議修訂的《病毒性肝炎防治方案》診斷分型標(biāo)準(zhǔn)，所有患者均除外其他病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等[7]。根據(jù)B超檢查結(jié)果我們將45例CHB患者分為3組，其中單純CHB15例(B超提示肝膽脾胰無異常)，CHB慢性肝病15例(B超提示慢性肝病改變)，CHB肝硬化15例(B超提示肝硬化)。15例單純CHB患者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均42.60±10.02歲，15例CHB慢性肝病患者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均44.40±11.19歲;15例CHB肝硬化患者，男性10例，女性5例，年齡28～65歲，平均46.00±10.97歲。15例ASCs者，男性9例，女性6例，年齡25～65歲，平均41.47±11.09歲。15例正常對照者為筆者醫(yī)院健康體檢者，男性9例，女性6例;年齡25～65歲，平均43.73±11.24歲，均無肝炎病史，除外病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎、自身免疫性肝病、遺傳性肝病等，肝功能均正常。45例應(yīng)用核苷類似物抗病毒治療病人的用藥時間為1～5年，HBV-DNA均低于檢測值水平，且血清ALT、AST均在正常范圍內(nèi)，其中使用拉米夫定13例，阿德福韋酯11例，替比夫定9例，恩替卡韋7例，另有5例病人為拉米夫定加阿德福韋酯聯(lián)合抗病毒。所有病人近6個月內(nèi)均未接受免疫調(diào)節(jié)劑及保肝降酶或抗纖維化藥物治療。

2.實驗方法:(1)主要試劑和儀器:美國BD FACS流式細(xì)胞儀，小鼠抗人 CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluor?647、mouse IgG1-PE、mouse IgG1-APC 均購自美國 BD Pharmingen公司。SEMENS公司全自動生化分析儀進(jìn)行肝功能檢測。HBV-DNA采用熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測，按深圳匹基生物工程股份有限公司試劑盒說明書進(jìn)行操作。ELISA檢測血漿TGF-β1水平，人TGF-β1ELISA試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，按照說明書進(jìn)行操作。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg的水平:采集患者及健康體檢者外周靜脈血2ml，EDTA抗凝。同時取2個流式試管，分別加入CD4-FITC/mouse IgG1-PE/mouse IgG1-APC和CD4-FITC/CD25-PE/CD127-Alexa Fluor?647各 5μl，每管再加 40μl抗凝全血，混勻，避光孵育30min，2ml溶血素溶血，PBS洗滌2次，流式細(xì)胞儀檢測，CellQuest v3.2軟件獲取及分析，計算外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg占CD4+淋巴細(xì)胞比例。

結(jié) 果

1.各組患者臨床特點及血清生化各相關(guān)指標(biāo)及血漿TGF-β1水平檢測結(jié)果，如表1、表2所示。

表1 各組患者臨床特征及核苷類似物使用情況(n)

表2 各組患者臨床特征、各項生化指標(biāo)及TGF-β1檢測結(jié)果

2.多色熒光分析法檢測外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg的數(shù)量，如圖1所示。不同組患者外周血中CD4+CD25+CD127lo/-Treg水平的數(shù)量檢測結(jié)果，如表3所示。

圖1 外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg數(shù)量

表3 各組患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg數(shù)量檢測結(jié)果比較()

表3 各組患者CD4+CD25+CD127lo/-Treg數(shù)量檢測結(jié)果比較()

a與健康對照組比較，其中a*P＜0.05，a＊＊P＜0.01;b與慢性HBV攜帶組比較;c與慢乙肝組比較，其中c*P＜0.05;d與慢乙肝肝纖維化組比較

3.不同組患者外周血CD4+CD25+CD127lo/-Treg數(shù)量與各指標(biāo)的關(guān)系:相關(guān)系數(shù)及顯著性見表4。Treg數(shù)量與各項指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，在全部受檢者中Treg數(shù)量與年齡之間正相關(guān)(r=0.327，P=0.004)，與血清AST水平之間正相關(guān)(r=0.324，P=0.005)，與血漿 TGF-β1水平正相關(guān)(r=0.306，P=0.008)，相關(guān)性散點圖見圖2。而與 HBeAg定量，血清 ALT水平之間無顯著相關(guān)性(r分別為0.177、0.129，P 分別為 0.130、0.270)。

表4 Treg與不同組患者各項生化指標(biāo)相關(guān)性分析

圖2 Treg與年齡、AST、TGF-β1相關(guān)性散點圖

4.各組 Treg、年齡、AST、TGF- β1水平比較:結(jié)果見圖3。

圖3 不同組Treg、年齡、AST、TGF-β1比較情況

討 論

HBV感染慢性化的機(jī)制比較復(fù)雜，其中機(jī)體免疫清除病毒的能力發(fā)揮極為重要的作用，它既能夠控制病毒的復(fù)制和清除、促臨床恢復(fù)和使機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的免疫應(yīng)答，也會導(dǎo)致炎癥損傷遷延不愈，肝纖維化發(fā)生，甚至發(fā)展為肝硬化、肝癌等。Treg的發(fā)現(xiàn)使人們對免疫調(diào)節(jié)及免疫耐受有了新的認(rèn)識，機(jī)體可能更主要的是通過Treg以“主動”的方式維持自身免疫耐受，在機(jī)體發(fā)生一些病原微生物感染時，體內(nèi)的CD4+CD25+Treg的數(shù)量可以增多，且可抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖及Th1/Th2細(xì)胞因子的分泌，從而影響機(jī)體抗感染免疫應(yīng)答的發(fā)生，導(dǎo)致感染的持續(xù)[8]。CD4+CD25+Treg最基本的分子表達(dá)特征為持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)CD25，F(xiàn)oxp3是CD4+CD25+Treg細(xì)胞分化發(fā)育和功能維持的重要調(diào)控基因，可作為人CD4+CD25+Treg細(xì)胞的特異性標(biāo)志。但Foxp3屬胞內(nèi)蛋白，標(biāo)記后的細(xì)胞已被破壞不能用于進(jìn)一步的培養(yǎng)和研究。Liu等發(fā)現(xiàn)CD127可以幫助識別CD4+CD25+Treg細(xì)胞與活化的T細(xì)胞，CD127的低表達(dá)與Foxp3表達(dá)極其一致且與CD25中等到強(qiáng)表達(dá)有良好的相關(guān)性，即真正的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞僅表達(dá)較低的CD127，因此在CD4+CD25+基礎(chǔ)上聯(lián)合CD127 lo/- 可以更好地識別人 CD4+CD25+Treg 細(xì)胞[9，10]。

我們使用CD4+CD25+CD127lo/-來標(biāo)記CD4+CD25+Treg細(xì)胞，檢測應(yīng)用核苷類似物抗病毒治療后HBV-DNA低于檢測值水平，肝功能ALT、AST在正常范圍內(nèi)的CHB患者，根據(jù)其B超檢測結(jié)果將其分為單純CHB，CHB慢性肝病及CHB肝硬化3組，并選擇同樣ALT、AST正常的ASCs患者和正常成年人一起作為對照來觀察這一部分患者外周血中CD4+CD25+Treg水平并分析其與患者年齡，HBeAg定量、ALT、AST、TGF-β1水平的相關(guān)性。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在抗病毒治療后單純CHB患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量較ASCs組顯著降低，與正常組沒有顯著差異，提示在HBV慢性感染的免疫調(diào)節(jié)中，Treg可能發(fā)揮了維持機(jī)體效應(yīng)細(xì)胞免疫清除HBV的穩(wěn)態(tài)的作用，在ASCs患者中Treg的數(shù)量增加使得機(jī)體維持保護(hù)性免疫，避免激發(fā)過度的免疫反應(yīng)所致的肝臟病理損傷的同時也造成病毒在機(jī)體的持續(xù)存在。而在抗病毒治療后隨著HBV DNA的清除，Treg數(shù)量也隨著致病因素的去除而相應(yīng)下降，也表明當(dāng)CHB患者自身免疫耐受打破后，Treg的數(shù)量或許可以一定程度上反映CHB患者體內(nèi)HBV DNA的清除情況。

同樣抗病毒治療后的CHB慢性肝病患者及CHB肝硬化患者外周血中Treg數(shù)量較之健康對照者和抗病毒治療后CHB組顯著增高。且在所有受檢者中Treg的數(shù)量與年齡、血清AST水平、血漿TGFβ1水平正相關(guān)。我們比較了各組年齡、血清AST水平、血漿TGF-β1水平，發(fā)現(xiàn)各組年齡之間無顯著差異，單純CHB患者組的AST水平及TGF-β1水平則明顯低于CHB慢性肝病組和肝硬化組。

AST主要分布在肝細(xì)胞質(zhì)和肝細(xì)胞的線粒體中，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重壞死或破壞時，肝細(xì)胞的線粒體也遭到了嚴(yán)重的破壞，AST從線粒體和胞質(zhì)內(nèi)釋出，可以一定程度上反映肝臟損傷壞死情況。Treg在血清ALT、AST維持在正常范圍內(nèi)的受試者中仍與AST存在顯著正相關(guān)，也提示Treg可能更能敏感的反應(yīng)肝臟的損傷程度，當(dāng)肝細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷和壞死的時數(shù)量會增加，以阻止機(jī)體過度的免疫損傷引起的炎癥。慢性肝病進(jìn)展過程中肝臟發(fā)生纖維化時中心環(huán)節(jié)是HSC的活化，最關(guān)鍵的細(xì)胞因子是TGF-β1。TGF-β1對HSC的增生活化具有極其重要的作用，是最強(qiáng)的促纖維化生成因子。早期肝損傷時，體內(nèi)的炎性細(xì)胞如活化的巨噬細(xì)胞等能分泌大量細(xì)胞因子如TGF-β1、TNF-α、EGF、PDGF等，刺激 HSC 活化轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞;同時活化后的HSC可以自分泌TGF-β1、TNF-α等因子，促進(jìn)自身進(jìn)一步活化。而細(xì)胞因子之間通過各種細(xì)胞間的數(shù)種信號傳導(dǎo)通路可互相作用，一旦啟動，會產(chǎn)生級鏈瀑布式的效應(yīng)，在炎癥后階段即使去除原來的肝損因素，也會導(dǎo)致肝纖維化形成的持續(xù)[11，12]。而Treg能夠分泌細(xì)胞因子TGF-β1，同時體外實驗研究也表明TGF-β1能夠誘導(dǎo)CD4+CD25-T向CD4+CD25+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及促進(jìn)Foxp3表達(dá)[13]。因此，我們推測存在在CHB組與CHB慢性肝病、肝硬化組之間血清AST和血漿TGF-β1水平的顯著差異，可能也是Treg在這3組存在顯著差異的原因。也表明低水平AST時Treg的增加更能提示肝臟慢性損傷程度。

對于Treg在抗病毒治療后的CHB慢性肝病、肝硬化患者外周血中仍增高的原因，我們推測，Treg可以敏感地反映存在于慢性肝病、肝硬化患者體內(nèi)肝臟的炎癥損傷情況，保護(hù)肝臟避免過度免疫激發(fā)所致的病理損傷，同時Treg分泌的TGF-β1等可能促進(jìn)了HSC的活化;或者通過細(xì)胞直接接觸與作為APC的HSC發(fā)生作用，促進(jìn)肝纖維化發(fā)生;而在肝纖維化肝硬化時患者體內(nèi)及HSC活化后肝臟局部的纖維化微環(huán)境中各種細(xì)胞因子，包括由活化后的HSC自分泌的TGF-β1等可能也促進(jìn)了Treg的進(jìn)一步增殖分化和發(fā)揮功能作用[11～15];或者以上幾種作用方式同時存在，并相互關(guān)聯(lián)，互為反饋，與其他致纖維化因素一起促進(jìn)慢性肝病、肝硬化的形成。因此，Treg可能參與了慢性HBV感染后肝臟疾病慢性化進(jìn)展的過程。我們將進(jìn)一步配合肝活檢檢測慢性乙型肝炎肝纖維化、肝硬化患者肝組織中Treg的表達(dá)情況及動態(tài)觀測抗病毒治療過程中患者自身對照其外周血Treg數(shù)量的變化，并進(jìn)行體外實驗來研究Treg在慢性HBV感染后對肝臟疾病慢性化進(jìn)展中的具體作用和機(jī)制。

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