班媛媛 李道勝 李曉梅 龐 宇 葉 紅

肺癌為當(dāng)前世界病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌所占比例高達(dá)85%。微小染色體維持蛋白(minichromosomemaintenance proteins，MCM)家族，是一組與DNA復(fù)制和細(xì)胞增生密切相關(guān)的蛋白家族，許多研究發(fā)現(xiàn)它的mRNA水平在細(xì)胞周期中呈周期性變化，只在增殖細(xì)胞中表達(dá)，在靜止細(xì)胞中不表達(dá)，而且每個(gè)細(xì)胞周期只表達(dá)一次。它的檢測(cè)水平的增高不但標(biāo)志著惡性細(xì)胞的增殖，而且標(biāo)志著非典型細(xì)胞的增生和潛在癌性細(xì)胞的增生。因此，MCM可以作為腫瘤有效標(biāo)志物的候選因子。我們應(yīng)用免疫組化方法，對(duì)非小細(xì)胞肺癌石蠟包埋組織標(biāo)本中的MCM5進(jìn)行檢測(cè)，觀察其在病變組織中的表達(dá)，探討了其與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集泰安市中心醫(yī)院2008年～2010年收治的、經(jīng)病理檢查確診的非小細(xì)胞肺癌石蠟包埋存檔組織78例，其中男性50例，女性28例。年齡36～80歲。組織學(xué)分類:鱗狀細(xì)胞癌46例，腺癌32例，其中高分化19例，中分化39例，低分化20例。78例中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例;根據(jù)2002年國(guó)際抗癌聯(lián)盟TNM分期:Ⅰ期20例，Ⅱ期27例，Ⅲ期31例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放療及化療，癌旁正常肺組織標(biāo)本40例。

1.2 免疫組化法

每一病例蠟塊連續(xù)切片1張，厚5μm。MCM5購(gòu)自北京中杉金橋生物公司，染色均采用免疫組化SP法，用微波修復(fù)抗原。MCM5染色用從生物公司購(gòu)買的陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以封閉血清代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

MCM5免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞核，陽(yáng)性物質(zhì)呈黃色顆粒狀，染色強(qiáng)時(shí)可呈棕褐色。采用Greenspan半定量法［1］對(duì)細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分率進(jìn)行評(píng)分。①根據(jù)每張切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:細(xì)胞內(nèi)無(wú)染色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;棕褐色為3分。②按組織切片中的陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)占全部腫瘤細(xì)胞百分比記分(隨機(jī)取10個(gè)高倍鏡視野的平均數(shù)):陽(yáng)性細(xì)胞率為0，記0分，＜10%為1分，10% ～50%為2分，＞50%為3分。③按上述兩項(xiàng)指標(biāo)的分?jǐn)?shù)乘積分為:0分為陰性(－)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中度陽(yáng)性(++)，＞4分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。MCM5蛋白陽(yáng)性率的分析比較采用卡方檢驗(yàn)和Fisher＇s精確概率檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌組及正常肺組織組中的MCM5蛋白表達(dá)情況(表1)

MCM5蛋白在正常肺組織組和非小細(xì)胞肺癌組中陽(yáng)性率分別為12.50%和59.97%，兩組比較有顯著性差異(χ2=23.27 ，P=0.000)。

2.2 MCM5表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系(表2)

MCM5陽(yáng)性表達(dá)與NSCLC組織學(xué)類型及分化程度無(wú)關(guān);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性組與陰性組陽(yáng)性表達(dá)率比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.907，P=0.015);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.657，P=0.031)。

3 討論

在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞周期調(diào)控異常是其內(nèi)在原因，細(xì)胞增殖調(diào)控異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，而腫瘤細(xì)胞增殖活性與腫瘤生物學(xué)行為更是密切相關(guān)，是用于反映腫瘤良惡性及惡性程度的重要指征。研究發(fā)現(xiàn)，MCM蛋白與細(xì)胞周期密切相關(guān)，是啟動(dòng)細(xì)胞DNA復(fù)制并調(diào)控細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵性蛋白，其本質(zhì)是1種核蛋白復(fù)合物。目前發(fā)現(xiàn)在靜止/分化細(xì)胞中MCM蛋白不表達(dá)，而在增殖/腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的1種較好地反映細(xì)胞增殖活性的新指標(biāo)。大量研究表明［2，3］MCM蛋白能夠敏感而特異地反映細(xì)胞的增殖狀況，在判斷腫瘤的惡性度及評(píng)估預(yù)后方面有著較重要的意義。MCM 5是MCM蛋白復(fù)合物之一，是1種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的因子，它的檢測(cè)可直接反映MCM蛋白的表達(dá)水平［4］。Sirieix等［5］檢測(cè)食管標(biāo)本發(fā)現(xiàn)在食管癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而在大多研究表明，MCM5與惡性腫瘤的發(fā)生、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移及惡性程度關(guān)系密切，可以作為預(yù)測(cè)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展和判斷預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，為惡性腫瘤的臨床治療提供可靠的理論依據(jù)。國(guó)內(nèi)以往對(duì)乳腺癌［6］、食管癌［7］等進(jìn)行過(guò)研究，取得了一些進(jìn)展，但對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究甚少，其檢測(cè)在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)可能具有更重要臨床意義。

表1 非小細(xì)胞肺癌及正常肺組織中MCM5蛋白表達(dá)情況(例，%)

表2 MCM5表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例，%)

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MCM5在正常肺組織、非小細(xì)胞肺癌組織中均存在不同程度的表達(dá)，且陽(yáng)性率呈上升趨勢(shì)，正常肺組織、非小細(xì)胞肺癌組織中其表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與段智［6］、趙銘等［7］在乳腺癌及食管癌中的結(jié)果基本一致。Sirieix等［6］檢測(cè)食管標(biāo)本發(fā)現(xiàn)MCM5在食管癌中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在大多數(shù)正常食管黏膜中為陰性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示MCM5能較好地反映腫瘤細(xì)胞的增殖特性，對(duì)腫瘤的診斷有一定意義，說(shuō)明MCM5可能參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和進(jìn)展;在非小細(xì)胞肺癌中，MCM5陽(yáng)性率與腫瘤分化程度無(wú)關(guān)。MCM5陽(yáng)性率與TNM分期及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均有相關(guān)性。說(shuō)明MCM5作為強(qiáng)有力的增殖指標(biāo)，它的高表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。與 Cinzia的試驗(yàn)結(jié)果一致［8］，本文結(jié)果提示，MCM5可能是區(qū)分非小細(xì)胞肺癌不同病理分期的有價(jià)值的分子標(biāo)志物，對(duì)治療選擇及預(yù)后評(píng)估有參考意義，但有待于后繼更大樣本驗(yàn)證。本研究表明，MCM5表達(dá)，對(duì)非小細(xì)胞肺癌的輔助診斷也具有一定的價(jià)值。

總之，MCM5蛋白可能與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能促進(jìn)癌組織的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，其陽(yáng)性表達(dá)可能反映了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖活性，并能估計(jì)非小細(xì)胞肺癌發(fā)生浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的潛能。

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