劉衍志，崔 燎

(1.廣東天然藥物研究與開發(fā)重點實驗室，廣東 湛江 524023;2.廣東醫(yī)學(xué)院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

1 簡介

HPMA(N－2－羥丙基-甲基丙烯酰胺聚合物)是1975年由Kopecek實驗室研究合成出來的多聚物。起初HPMA被設(shè)計成血漿增容劑，幾十年后此種水溶性多聚物的應(yīng)用范圍不斷擴展，從工業(yè)應(yīng)用到大分子藥物，逐漸在高分子治療領(lǐng)域中扮演重要的角色。HPMA最先應(yīng)用于作為抗癌藥物的載體，取得了顯著的成效，現(xiàn)在至少有5種相關(guān)藥物處在不同的臨床試驗階段［1］。隨著對HPMA藥物輸送系統(tǒng)研究的不斷深入，HPMA用于藥物載體的研究逐漸拓展到骨骼疾病與炎癥疾病等領(lǐng)域。

HPMA的創(chuàng)造者Kopecek說，經(jīng)過詳細研究一系列親水性聚合物的結(jié)構(gòu)和它們的生物相容性的關(guān)系后，選擇了N取代的甲基丙烯酰胺做為他們的目標(biāo)，因為在α－碳取代和N－取代的酰胺鍵能夠保證聚合物側(cè)鏈的水解穩(wěn)定性［2］。把HPMA作為藥物載體的特點如下:

1.1 合成方法簡單 HPMA可以通過共聚作用，同型聚合反應(yīng)［3］，以及多種單體聚合而合成。聚合物的分子量和多分散性可以通過游離自由基聚合反應(yīng)控制，比如說ATRP或者是 RAFT 技術(shù)［4，5］

1.2 合成出的多聚物具有良好的水溶性和生物相容性 改進疏水性小分子藥物的水溶性，使藥物分子的生物利用度增高，保護不穩(wěn)定分子使其不容易降解，增加藥物分子在血漿內(nèi)的循環(huán)時間，降低藥物的非特異性毒性以及增加藥物在目標(biāo)位點的累積［6］。

1.3 聚合物側(cè)鏈可通過多種反應(yīng)添加多種治療分子，靶向分子，以及示蹤分子。HPMA與藥物連接結(jié)構(gòu)是藥物靶向到預(yù)定部位釋放的重要的組成部分，根據(jù)對藥物機理的研究加上對特定組織或器官具體微環(huán)境特點的研究，用不同的連接結(jié)構(gòu)接上各種功能性因子［7～9］。

1.4 從機理上看，對HPMA復(fù)合藥物輸送系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)可以改變藥物的內(nèi)化，細胞內(nèi)的運輸路徑，增強藥物的作用和靶向性［10］。

2 HPMA應(yīng)用于骨靶向輸送系統(tǒng)的研究

目前大部分治療骨骼疾病的藥物都沒有針對骨骼的特異性，而且集中于抗骨吸收藥物，在一些促骨形成藥物的研究中，雖然一些藥物有很好的促骨形成效果，但是常常也伴隨著較強的副作用，限制了此類藥物的臨床應(yīng)用。例如前列腺素1和2以及它們的類似物、PTH等。因此學(xué)者們致力于研究靶向骨骼的藥物。骨骼是一種特殊的器官，它與其他軟組織和器官的區(qū)別在于含有大量的羥基磷灰石?；诖颂攸c，研究者們致力于尋找與羥基磷灰石具有強烈親和力的分子，目前主要有四環(huán)素(TC)，鈣黃綠素，雙磷酸鹽(BPs)，D構(gòu)型天冬氨酸寡肽(D－Aspx)等。

2.1 HPMA－TC 首先被選為與HPMA相結(jié)合的靶向分子是四環(huán)素。四環(huán)素是一種常見的抗生素，其對骨內(nèi)羥基磷灰石(HA)有著強烈的親和力，因此極容易沉積于骨骼和牙齒中，在骨骼和牙齒的新生階段尤為常見。在骨形態(tài)計量領(lǐng)域常被用來作為骨骼形成的標(biāo)記物。前期的研究者利用結(jié)構(gòu)簡單的TC結(jié)構(gòu)類似物(ATC)合成HPMA－TC復(fù)合物［11］，在最初動物體內(nèi)試驗表明，此復(fù)合物能很好的與體內(nèi)的羥基磷灰石相結(jié)合，但是復(fù)合物在單次的大劑量注射后，出現(xiàn)動物死亡。急性的低血鉀癥被懷疑是主要的原因。

2.2 HPMA－ALN 雙磷酸鹽類藥物能夠強力抑制骨的吸收，而且對骨骼內(nèi)的羥基磷灰石有非常好的親和力。單次注射阿侖膦酸鈉(ALN)，總藥量的50%都分布在骨骼上。進一步發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)ALN能強力附著在各種類型的骨表面，體外ALN對羥基磷灰石的附著實驗證明［12］，其對羥基磷灰石結(jié)晶度成熟程度并不敏感，在各種類型的羥基磷灰石均可很好的附著。這些研究使得ALN作為骨靶向的前藥有很好的前景。

在合成HPMA－ALN聚合物的早期，合成的策略是先合成甲基丙烯酸ALN單體，然后再聚合成HPMA－ALN，但這樣的策略無法用常規(guī)方法從得到的甲基丙烯酸鹽衍生物中分離出合成產(chǎn)物甲基丙烯酸ALN單體。后來轉(zhuǎn)為利用同型聚合物反應(yīng)，仍然存在低反應(yīng)率，低ALN配合率的問題，產(chǎn)物的分離要求也比較高(需制備型HPLC)［13］。因此合成HPMA－ALN的路線尚需研究優(yōu)化。FITC標(biāo)記的HPMAALN在動物體內(nèi)實驗證明，復(fù)合物能夠有效的螯合到骨骼上，特別是螯合在骨高轉(zhuǎn)換位點［14］。

Satchi－Fainaro的實驗室利用HPMA－ALN復(fù)合物的親骨特性，在HPMA上接入強力的血管生成抑制因子TNP－470用于靶向骨腫瘤的治療，取得了很好的效果［15］。通過可逆加成－斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(RAFT)將HPMA、ALN以及TNP－470連接形成復(fù)合物HPMA－ALN－TNP－470。此復(fù)合物帶有一個組織蛋白酶K－清除連接基團，當(dāng)復(fù)合物正確到達骨骼位點后，裂解釋放TNP－470。HPMA－ALN－TNP－470復(fù)合物能夠通過抑制內(nèi)皮細胞和骨肉瘤細胞的分化、遷移以及類毛細血管樣微管形成，減少腫瘤的高血管滲透性，小鼠體內(nèi)實驗表明，復(fù)合物能顯著抑制人骨腫瘤生長達96%。

2.3 HPMA－Aspx 研究證實陰極氨基酸是一些骨相關(guān)蛋白的主要構(gòu)成成分，而發(fā)現(xiàn)唾液蛋白能夠強烈的與牙釉質(zhì)相結(jié)合的原因是由于唾液蛋白的一級結(jié)構(gòu)中存在有陰性氨基酸序列。因此，陰性氨基酸序列可被用于發(fā)展成為骨靶向藥物的靶向分子。在合成出雌二醇與天冬氨酸六肽(Asp6)的復(fù)合物(E2·3D6)實驗中單次注射一天后，骨骼內(nèi)的雌二醇含量是單用雌二醇的100倍，在骨骼中聚集了有效濃度的雌二醇刺激骨形成，延緩骨丟失，而且E2·3D6的使用不會像單用E2那樣，出現(xiàn)肝臟肥大等副作用［16］。

天冬氨酸寡肽與HA的結(jié)合能力只與氨基酸的數(shù)目相關(guān)，研究者為了得到更好的骨靶向性，選擇了合成用FITC(異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的D構(gòu)型天冬氨酸八肽與HPMA復(fù)合物(HPMA－GG－D －Asp8－FITC)［7］。在體外的羥基磷灰石結(jié)合實驗中，復(fù)合物能迅速的與羥基磷灰石結(jié)合，1 h內(nèi)，80%的復(fù)合物都附著在羥基磷灰石上。健康小鼠靜脈注射劑量0.5 g·kg－1P－GG －D －Asp8－FITC，在24 h后取長骨切片計量學(xué)結(jié)果顯示，骨干的內(nèi)膜、外膜以及骨干骺端的骨表面均可見復(fù)合物附著，尤其在骨轉(zhuǎn)換高的區(qū)域，比如骨干骺端的松質(zhì)骨區(qū)域［14］。復(fù)合物在去卵巢三個月后的大鼠(OVX)體內(nèi)實驗，依舊使用0.5 g·kg－1劑量的 HPMA －GG－D－Asp8－FITC注射，結(jié)果同樣顯示，復(fù)合物能夠很好的結(jié)合在骨轉(zhuǎn)換高的位點［17］。

HPMA－D－Asp8與HPMA－ALN骨形態(tài)計量學(xué)對比研究發(fā)現(xiàn)，雖然兩者都很好的結(jié)合在骨高轉(zhuǎn)換位點，但是它們結(jié)合的區(qū)域并不完全相同，HPMA－ALN在骨轉(zhuǎn)換中的骨形成和骨吸收區(qū)域都有分布，而HPMA－D－Asp8更傾向于分布在骨吸收表面。在一項ALN與Asp8體外對羥基磷灰石結(jié)合度的對比實驗證實了兩者的區(qū)別，首先ALN與牙釉質(zhì)的平均親和力有190 N，而Asp8的親和力只有100 N。其次ALN與Asp8分別與兩種結(jié)晶度不同的羥基磷灰石進行粘合實驗，結(jié)果ALN與不同結(jié)晶度的羥基磷灰石粘合百分率相同，而Asp8粘合百分率顯著傾向于成熟的，結(jié)晶度高的羥基磷灰石(例如骨吸收表面)［12］。

至此，總結(jié)一下可以得出，TC，D－Asp8，ALN三種靶向分子的特性，TC青睞骨形成表面，D－Asp8青睞骨吸收表面，而ALN則可以等同分布于兩種表面。

這些研究結(jié)果使得研究者今后在研究骨靶向藥物的時候，能夠不僅僅是將藥物靶向到骨骼，而是可以通過選擇不同的靶向分子使藥物能夠更進一步的靶向到骨的不同表面，從而發(fā)揮更為準(zhǔn)確的作用。

2.4 HPMA－PGE1PGE1是強力的促骨生成因子，當(dāng)給予促骨合成劑量范圍的藥物時，PGE1能夠激活相應(yīng)骨細胞表面上的的EP受體達到促骨合成的作用。它被選為第一個與HPMA聚合物靶向骨骼疏松系統(tǒng)相結(jié)合的治療因子，利用之前介紹過的對骨骼有很好靶向性的P－Asp8與PGE1相結(jié)合，形成一個靶向骨骼的藥物輸送系統(tǒng)(HPMA－D－Asp8－PGE1)。此復(fù)合物包含了雙靶向的設(shè)計(D－Asp8和組織蛋白酶K特異性裂解片段)。首先D－Asp8將藥物系統(tǒng)靶向骨骼，當(dāng)復(fù)合物粘附骨骼，由于破骨細胞特異性表達組織蛋白酶K，尤其傾向于粘附在骨吸收表面，特異性裂解片段裂解，釋放PGE1。這樣的輸送系統(tǒng)首先能大大減少PGE1的副反應(yīng);其次使PGE1能在最需要新骨形成的區(qū)域(骨吸收表面)刺激新骨形成，保持甚至改善骨質(zhì)量;再次P－Asp8－PGE1復(fù)合物能夠避免PGE1在到達釋放位點之前，各種可能的消除機制對PGE1的破壞，延長PGE1在體內(nèi)的半衰期，最后復(fù)合物輸送系統(tǒng)能在完成輸送任務(wù)后再從骨骼中裂解清除，通過腎小球濾過排出體外［2］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物進行了體外細胞評價實驗，復(fù)合物分別引入到破骨細胞，成骨細胞，在它們的前體細胞以及非骨骼細胞中，觀察復(fù)合物對細胞的影響及其進入細胞的途徑。共聚焦熒光顯微鏡的結(jié)果顯示，細胞均通過內(nèi)吞作用將復(fù)合物“吃”入細胞，并聚集于溶酶體/內(nèi)體區(qū)域，然后裂解釋放PGE1。在人源的細胞培養(yǎng)實驗中，PEG1的釋放順序為破骨細胞(FLG－OC)＞成骨細胞(Saos－2－OB)成骨前體細胞(Saos－2)，破骨前體細胞(FLG29.1)，以及控制組細胞(HS－5)。在鼠源的細胞培養(yǎng)實驗中與人源的基本一致，但有細微差別。此實驗證實HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物能順利的進入破骨/成骨細胞內(nèi)，通過結(jié)構(gòu)中的組織蛋白酶K裂解片段的裂解釋放PEG1，間接證實了藥物輸送系統(tǒng)將在骨骼高轉(zhuǎn)換區(qū)域富集并發(fā)揮作用。另外實驗還發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶L和酯酶也是對PEG1的釋放發(fā)揮作用的酶［18］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物在老年去卵巢大鼠(OVX)的體內(nèi)實驗顯示［19］，單次注射28 d后，去卵巢大鼠的骨形成率(BFR)，礦化表面百分率(MS)等骨形成指標(biāo)與非靶向?qū)φ战M相比顯著提高，并且HPMA－D－Asp8－PGE1的注射沒有發(fā)現(xiàn)常常伴隨著單純PEGs注射出現(xiàn)的顯著的不良反應(yīng)。更為重要的是，PGE1與HPMA形成靶向藥物輸送系統(tǒng)后，復(fù)合物中含有的少量PEG1能夠達到以往使用大量PGE1才能達到的生骨效果。

雖然HPMA－D－Asp8－PGE1靶向輸送系統(tǒng)展示了很好的效果，但還面臨著一些問題。在人、大鼠、小鼠血漿，37℃溫育測定藥物穩(wěn)定性實驗中。HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物在人血漿中表現(xiàn)穩(wěn)定，但在鼠類血漿中卻釋放了大量的PGE1，這可能是復(fù)合物結(jié)構(gòu)中PGE1與HPMA相連的酯鍵在血漿中裂解釋放了PGE1，在大鼠血漿中，酯鍵主要由丁酰膽堿酯酶催化裂解，而在小鼠血漿中，酯鍵的裂解不僅由丁酰膽堿酯酶催化，羧酸酯酶也參與了裂解［20］。這樣的種屬特異性使得HPMA－D－Asp8－PGE1靶向藥物的發(fā)展陷入了一種尷尬的境地，因為藥物的臨床前評價必須在鼠類模型及其他非鼠類動物模型上評估，所以即使復(fù)合物在人血漿中表現(xiàn)穩(wěn)定，但此在鼠類循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的缺陷，使得HPMA－DAsp8－PGE1必須進一步改良。值得慶幸的是，復(fù)合物在老年OVX大鼠上的實驗，并沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的與設(shè)計目的不符的結(jié)果。

3 HPMA藥物靶向輸送系統(tǒng)的設(shè)計與展望

目前HPMA藥物輸送系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的設(shè)計主要分為四部分，以HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物為例。①是HPMA;②是靶向分子;③是治療分子;④是連接靶向分子和藥物分子的連接基團 ，如圖1。

3.1 HPMA分子的設(shè)計

3.1.1 HPMA的分子量的大小是藥物輸送系統(tǒng)在體內(nèi)循環(huán)半衰期，消除半衰期，以至輸送系統(tǒng)的被動靶向性的關(guān)鍵因素。分子量大的輸送系統(tǒng)能夠獲得更長的半衰期，但其在肝和脾的聚集也響應(yīng)增多［17］。

3.1.2 HPMA的構(gòu)型(如圖2)是藥物的合成，藥物的釋放率等方面的關(guān)鍵因素，好的構(gòu)型設(shè)計能夠提高藥物在體內(nèi)的運輸效率，提高藥效，同時在被動靶向性方面也將帶來益處(例如高通透性和滯留效應(yīng)，EPR)，但是復(fù)雜的構(gòu)型設(shè)計將給藥物合成階段帶來困難，而且構(gòu)型產(chǎn)生的空間位阻也會給藥物的釋放帶來影響。目前按HPMA的側(cè)鏈連接的位置不同主要分為:①直線型;②側(cè)鏈型;③雙鏈HPMA交聯(lián)型;(4)多條或者星形HPMA交聯(lián)型。每一種形態(tài)的空間結(jié)構(gòu)對于聚合物在體內(nèi)的清除率都有重要的影響，目前輸送系統(tǒng)設(shè)計主要的應(yīng)用在側(cè)鏈型HPMA。

圖1 HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物的結(jié)構(gòu)

圖2 HPMA多聚物的結(jié)構(gòu)

3.2 藥物分子的連接基團設(shè)計 連接基團的設(shè)計是HPMA藥物靶向輸送系統(tǒng)中控制靶向/釋放的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，寡肽側(cè)鏈常被用于作為藥物粘結(jié)/釋放的位點。例如HPMA－Dox復(fù)合物［8］中出色的針對組織蛋白酶B特異的GFLG肽序列連接結(jié)構(gòu)的設(shè)計，在細胞通過內(nèi)吞作用將大分子物質(zhì)吸收同化并定位到溶酶體聚集的部位后，GFLG裂解釋放藥物;還有設(shè)計pH值敏感的連接結(jié)構(gòu)，基于對炎癥部位的微環(huán)境研究，炎癥部位酸性環(huán)境可為pH酸性敏感的連接結(jié)構(gòu)提供藥物釋放的場所［9］。在骨靶向藥物 HPMA－D－Asp8－PGE1復(fù)合物上，體現(xiàn)為－Gly－Gly－Pro－Nle－寡肽連接和1，6自我消除的4－胺芐醇結(jié)構(gòu)(圖中④和⑤)。那是研究者們參照HPMA－Dox的成功經(jīng)驗，針對組織蛋白酶K(破骨細胞特異分泌酶)設(shè)計的敏感寡肽序列。寡肽片段與PGE1之間用1，6自我消除的4－胺芐醇結(jié)構(gòu)連接，在寡肽片段被組織蛋白酶K降解，胺芐醇發(fā)生1，6自我消除，釋放PGE1。在這個設(shè)計思路中，胺芐醇與PGE1之間連接的酯鍵(圖1中箭頭)被證實為是該設(shè)計的一大缺陷。新的用于替代酯鍵的連接結(jié)構(gòu)和針對骨病理微環(huán)境產(chǎn)生的pH變化敏感的連接結(jié)構(gòu)都在發(fā)展中。

3.3 靶向分子和治療分子的設(shè)計 靶向骨骼的分子目前按結(jié)合區(qū)域可以分為:①四環(huán)素，鈣黃綠素及其衍生物——針對成骨表面;②D構(gòu)型Asp寡肽(Asp8，Asp6等)——針對破骨表面;③雙磷酸鹽——成骨破骨表面都青睞。

隨著針對骨骼的微環(huán)境，細胞亞細胞，分子研究的不斷深入，更多的親骨特性的因子將加入到靶向分子之中。治療分子的選擇今后也將擴展到傳統(tǒng)中醫(yī)藥領(lǐng)域的丹參素［21］，蛇床子素［22］，淫羊藿等以及分子醫(yī)藥領(lǐng)域抗DKK1蛋白抗體，SOST硬化蛋白抗體等［23，24］。另外以溶酶體為藥物釋放位點的HPMA－藥物復(fù)合物經(jīng)過內(nèi)吞作用進入細胞，在臨近核區(qū)釋放。我們可以得到啟示，在HPMA上接上針對DNA，RNA的調(diào)控因子，使得調(diào)控因子能夠直接進入核區(qū)發(fā)揮作用，這將給一些先天性缺陷疾病帶來福音，但這需要對藥物復(fù)合物在細胞亞細胞內(nèi)的運輸路徑和細胞內(nèi)微環(huán)境的更多的基礎(chǔ)研究做鋪墊。

HPMA上不斷重復(fù)的結(jié)構(gòu)和N－取代的酰胺鍵，使得一條HPMA側(cè)鏈上除了能添加多個靶向因子和治療因子，還能加上各種示蹤分子［25］，如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)等，展示了可以在一個簡單的結(jié)構(gòu)上實現(xiàn)各種不同的功能。理想的設(shè)計是與HPMA接上的不同功能的因子都能夠在合適的階段，合適的部位釋放，發(fā)揮自身固有的作用，而各種因子之間不相互干擾。但是多功能的復(fù)合物，或多或少都對其它分子產(chǎn)生一些影響(包括復(fù)合物分子間和復(fù)合物內(nèi)部的因子之間)。一條HPMA分子上有多個疏水基團，分子內(nèi)部或分子間的疏水作用力會讓疏水分子在局部空間上的聚集，形成微團結(jié)構(gòu)，這對藥物運輸、釋放率都將產(chǎn)生影響，因此在設(shè)計復(fù)合物時就應(yīng)該考慮到引入每一種因子，復(fù)合物在體內(nèi)的環(huán)境中所能產(chǎn)生的相互作用力對設(shè)計目的的影響。復(fù)合物的分子內(nèi)部和分子間的相互作用，主要由復(fù)合物鏈的大小和構(gòu)型，疏水結(jié)構(gòu)/分子的類型、含量以及在復(fù)合物中的位置，復(fù)合物的濃度以及其他因素(溫度，溶劑，pH值等)的影響［2］。隨著計算機技術(shù)在模擬藥物設(shè)計中的運用，結(jié)合多種物理檢測技術(shù)，將會指導(dǎo)和優(yōu)化特定復(fù)合物的設(shè)計。

3.4 展望 經(jīng)過30多年的發(fā)展，HPMA經(jīng)受了時間的考驗，展示了出色的生物相容性，分子載入的多功能性和完善發(fā)展的聚合物合成體系，使HPMA從眾多聚合物載體中脫穎而出，成為研究的熱點。大量的基礎(chǔ)研究和新的HPMA復(fù)合物目前集中在癌癥領(lǐng)域，對除癌癥之外的疾病尤其是在骨骼與肌肉疾病方面的研究和新的復(fù)合物還很少，可以預(yù)見在癌癥之外的疾病領(lǐng)域HPMA將迎來一個新的發(fā)展。

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